1. ஆரம்ப புரிதல்

இந்த கட்டத்தில், சில கருத்துகளையும் சொற்களையும் நாம் புரிந்து கொள்ள வேண்டும், இதன் மூலம் நமது மூத்தவர்களுக்கு முன்னால் தவறுகளை செய்வதைத் தவிர்க்க வேண்டும்:

கே: RT-PCR, qPCR, Real-time PCR மற்றும் நிகழ்நேர RT-PCR ஆகியவற்றுக்கு என்ன வித்தியாசம்?

பதில்: ஆர்டி-பிசிஆர் என்பது ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் பிசிஆர்(தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் PCR, RT-PCR), இது பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினையின் (PCR) பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படும் மாறுபாடு ஆகும்.RT-PCR இல், ஒரு RNA இழையானது நிரப்பு DNAவாக மாற்றியமைக்கப்படுகிறது, பின்னர் இது PCR ஆல் DNA பெருக்கத்திற்கான டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.
நிகழ்நேர-PCR மற்றும் qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) ஒன்றுதான், இரண்டும் நிகழ்நேர அளவு PCR ஆகும், அதாவது PCR இன் ஒவ்வொரு சுழற்சியும் நிகழ்நேர தரவுப் பதிவுகளைக் கொண்டுள்ளது, எனவே தொடக்க வார்ப்புருக்களின் எண்ணிக்கையை துல்லியமான பகுப்பாய்வு சரிசெய்ய முடியும்.

நிகழ்நேர PCR (நிகழ்நேர ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR) மற்றும் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் PCR (ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் PCR) இரண்டும் RT-PCR என சுருக்கமாகத் தோன்றினாலும், சர்வதேச மாநாடு: RT-PCR என்பது தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனைக் குறிக்கிறது.PCR , நிகழ்நேர PCR பொதுவாக qPCR (அளவு நிகழ்நேர PCR) என சுருக்கப்படுகிறது..

மற்றும் நிகழ்நேர RT-PCR (RT-qPCR), இது ஃப்ளோரசன்ட் அளவு தொழில்நுட்பத்துடன் இணைந்த தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் PCR ஆகும்.: முதலில் RNA ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனில் இருந்து cDNA (RT) ஐப் பெறவும், பின்னர் அளவு பகுப்பாய்வுக்கு (qPCR) நிகழ்நேர PCR ஐப் பயன்படுத்தவும்.பெரும்பாலான ஆய்வகங்கள் RT-qPCR, அதாவது RNA வெளிப்பாடு கீழ்-ஒழுங்குமுறை பற்றிய ஆராய்ச்சியை செய்கின்றன, எனவே ஆய்வகத்தில் அனைவரும் பேசும் qPCR உண்மையில் RT-qPCR ஐக் குறிக்கிறது, ஆனால் மருத்துவ பயன்பாடுகளில் இன்னும் பல DNA சோதனைகள் உள்ளன என்பதை மறந்துவிடாதீர்கள்.ஹெபடைடிஸ் பி வைரஸ் HBV கண்டறிதல் போன்ற அளவு பகுப்பாய்வு.

கேள்வி: நிறைய ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR ஐப் படித்த பிறகு, பெருக்கப்பட்ட துண்டு ஏன் 80-300bp வரம்பிற்குள் கட்டுப்படுத்தப்பட வேண்டும்?

பதில்: ஒவ்வொரு மரபணு வரிசையின் நீளமும் வேறுபட்டது, சில பல kb, சில நூற்றுக்கணக்கான bp, ஆனால் ப்ரைமர்களை வடிவமைக்கும்போது தயாரிப்பு நீளம் 80-300bp இருக்க வேண்டும், மிகக் குறுகிய அல்லது மிக நீளமானது ஒளிரும் அளவு PCR கண்டறிதலுக்கு ஏற்றது அல்ல.ப்ரைமர்-டைமரில் இருந்து வேறுபடுத்திப் பார்க்க முடியாத அளவுக்கு தயாரிப்பு துண்டு மிகவும் சிறியது.ப்ரைமர்-டைமரின் நீளம் சுமார் 30-40bp ஆகும், மேலும் இது 80bp க்கும் குறைவாக இருந்தால் அது ஒரு ப்ரைமர்-டைமர் அல்லது ஒரு தயாரிப்பு என்பதை வேறுபடுத்துவது கடினம்.தயாரிப்பு துண்டு மிக நீளமாக இருந்தால், 300bp ஐ விட அதிகமாக இருந்தால், அது எளிதாக குறைந்த பெருக்க செயல்திறனுக்கு வழிவகுக்கும் மற்றும் மரபணுவின் அளவை திறம்பட கண்டறிய முடியாது.

உதாரணமாக, ஒரு வகுப்பறையில் எத்தனை பேர் இருக்கிறார்கள் என்பதை நீங்கள் கணக்கிடும்போது, ​​எத்தனை வாய்கள் உள்ளன என்பதை மட்டும் கணக்கிட வேண்டும்.நீங்கள் மரபணுக்களைக் கண்டறியும் போது இதுவே உண்மை, முழு வரிசையும் குறிக்கும் ஒரு மரபணுவின் ஒரு குறிப்பிட்ட வரிசையை மட்டுமே நீங்கள் கண்டறிய வேண்டும்.நீங்கள் மக்களைக் கணக்கிட விரும்பினால், நீங்கள் வாய் மற்றும் மூக்கு, காது மற்றும் கண்ணாடி இரண்டையும் எண்ண வேண்டும், மேலும் தவறு செய்வது எளிது.

விரிவுபடுத்த, உயிரியல் ஆராய்ச்சியில், புள்ளியிலிருந்து பகுதிக்கு பல ஆய்வுகள் உள்ளன, ஏனெனில் எந்த உயிரினத்தின் மரபணு வரிசையும் மிக நீளமாக இருப்பதால், பாக்டீரியா 16S வரிசைமுறை போன்ற அனைத்து துண்டுகளையும் அளவிடுவது தேவையற்றது மற்றும் சாத்தியமற்றது.

கே: qPCR ப்ரைமர் வடிவமைப்பிற்கான உகந்த நீளம் என்ன?

பதில்: பொதுவாக, ப்ரைமர் நீளம் சுமார் 20-24bp ஆகும், இது சிறந்தது.நிச்சயமாக, ப்ரைமரை வடிவமைக்கும்போது ப்ரைமரின் டிஎம் மதிப்புக்கு நாம் கவனம் செலுத்த வேண்டும், ஏனெனில் இது உகந்த அனீலிங் வெப்பநிலையுடன் தொடர்புடையது.பல சோதனைகளுக்குப் பிறகு, 60 டிகிரி செல்சியஸ் ஒரு சிறந்த டிஎம் மதிப்பு என்று நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது.அனீலிங் வெப்பநிலை மிகவும் குறைவாக இருந்தால், அது எளிதில் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்திற்கு வழிவகுக்கும்.அனீலிங் வெப்பநிலை மிக அதிகமாக இருந்தால், பெருக்க செயல்திறன் ஒப்பீட்டளவில் குறைவாக இருக்கும், பெருக்க வளைவின் உச்சம் பின்னர் தொடங்கும், மேலும் CT மதிப்பு தாமதமாகும்.

கே: ஆய்வு முறையிலிருந்து சாய முறை எவ்வாறு வேறுபடுகிறது?

பதில்: சாய முறைSYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO போன்ற சில ஃப்ளோரசன்ட் சாயங்கள் தாங்களாகவே ஒளியை வெளியிடுவதில்லை, ஆனால் இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏவின் சிறிய பள்ளத்துடன் பிணைக்கப்பட்ட பிறகு ஒளிரும் தன்மையை வெளியிடும்.எனவே, PCR எதிர்வினையின் தொடக்கத்தில், இயந்திரம் ஒளிரும் சமிக்ஞையை கண்டறிய முடியாது.எதிர்வினை அனீலிங்-நீட்டிப்பு நிலையை அடையும் போது, ​​இரட்டை இழை திறக்கப்படுகிறது, மேலும் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் செயல்பாட்டின் கீழ் ஒரு புதிய இழை ஒருங்கிணைக்கப்படுகிறது, மேலும் ஃப்ளோரசன்ட் மூலக்கூறு டிஎஸ்டிஎன்ஏ சிறிய பள்ளத்துடன் பிணைக்கிறது.PCR சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை அதிகரிக்கும் போது, ​​மேலும் மேலும் சாயங்கள் இரட்டை இழை DNA உடன் இணைக்கப்படுகின்றன, மேலும் ஃப்ளோரசன்ட் சமிக்ஞையும் தொடர்ந்து மேம்படுத்தப்படுகிறது.சாய முறை முக்கியமாக அறிவியல் ஆராய்ச்சியில் பயன்படுத்தப்படுகிறது.
PS: பரிசோதனை செய்யும் போது கவனமாக இருங்கள், சாயம் மனித DNA உடன் இணைக்கப்பட வேண்டும், அதை ஒரு ஒளிரும் நபராக மாற்ற கவனமாக இருங்கள்.

சாய முறை (இடது) ஆய்வு முறை (வலது)
PS: பரிசோதனை செய்யும் போது கவனமாக இருங்கள், சாயம் மனித DNA உடன் இணைக்கப்பட வேண்டும், அதை ஒரு ஒளிரும் நபராக மாற்ற கவனமாக இருங்கள்.

SYBR பச்சை Ⅰ டிஎன்ஏவின் சிறிய பள்ளத்துடன் பிணைக்கிறது

ஆய்வு முறைதக்மான் ஆய்வு என்பது பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் நீராற்பகுப்பு ஆய்வு ஆகும்.ஆய்வின் 5′ முடிவில் ஒரு ஃப்ளோரசன்ட் குழு உள்ளது, பொதுவாக FAM, மற்றும் ஆய்வு என்பது இலக்கு மரபணுவுடன் ஒரு வரிசையை நிரப்புகிறது.3′ இறுதியில் ஒரு ஃப்ளோரசன்ட் தணிக்கும் குழு உள்ளது.ஃப்ளோரசன்ஸ் அதிர்வு ஆற்றல் பரிமாற்றத்தின் கொள்கையின்படி (Förster resonance energy transfer, FRET), நிருபர் ஃப்ளோரசன்ட் குழுவும் (நன்கொடையாளர் ஃப்ளோரசன்ட் மூலக்கூறு) மற்றும் அணைக்கும் ஃப்ளோரசன்ட் மூலக்கூறும் (ஏற்றுக்கொள்ளும் ஃப்ளோரசன்ட் மூலக்கூறு) உற்சாகமாக இருக்கும்போது, ​​​​நிறமாலை ஒன்றுடன் ஒன்று நெருங்கும்போது (7) தூரம் அதிகமாக இருக்கும். ஏற்பி மூலக்கூறின் ஒளிரும் தன்மை, ஆட்டோஃப்ளோரசன்ஸ் பலவீனமடையும் போது.எனவே, PCR எதிர்வினையின் தொடக்கத்தில், ஆய்வு இலவசம் மற்றும் கணினியில் அப்படியே இருக்கும் போது, ​​நிருபர் ஃப்ளோரசன்ட் குழு ஃப்ளோரசன்ஸை வெளியிடாது.அனீலிங் செய்யும் போது, ​​ப்ரைமர் மற்றும் ப்ரோப் ஆகியவை டெம்ப்ளேட்டுடன் பிணைக்கப்படுகின்றன.நீட்டிப்பு கட்டத்தில், பாலிமரேஸ் தொடர்ந்து புதிய சங்கிலிகளை ஒருங்கிணைக்கிறது.டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் 5′-3′ எக்ஸோநியூக்லீஸ் செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளது.ஆய்வை அடையும் போது, ​​டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் டெம்ப்ளேட்டிலிருந்து ஆய்வை ஹைட்ரோலைஸ் செய்யும், ரிப்போர்ட்டர் ஃப்ளோரசன்ட் குழுவை க்வென்சர் ஃப்ளோரசன்ட் குழுவிலிருந்து பிரித்து, ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னலை வெளியிடும்.ஆய்வுக்கும் டெம்ப்ளேட்டிற்கும் இடையே ஒருவருக்கு ஒருவர் தொடர்பு இருப்பதால், சோதனையின் துல்லியம் மற்றும் உணர்திறன் அடிப்படையில் சாய முறையை விட ஆய்வு முறை சிறந்தது.ஆய்வு முறை முக்கியமாக நோயறிதலில் பயன்படுத்தப்படுகிறது.

கே: முழுமையான அளவீடு என்றால் என்ன?Relative Quantification என்றால் என்ன?

பதில்: முழுமையான அளவீடு என்பது 1ml இரத்தத்தில் எத்தனை HBV வைரஸ்கள் உள்ளன என்பது போன்ற qPCR ஆல் சோதிக்கப்படும் மாதிரியின் ஆரம்ப நகல் எண்ணைக் கணக்கிடுவதைக் குறிக்கிறது.தொடர்புடைய அளவீடு மூலம் பெறப்பட்ட முடிவு, மற்றொரு குறிப்பு மாதிரியுடன் தொடர்புடைய ஒரு குறிப்பிட்ட மாதிரியில் இலக்கு மரபணுவின் அளவு மாற்றமாகும், மேலும் மரபணு வெளிப்பாடு மேல்-ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டது அல்லது கீழ்-ஒழுங்குபடுத்தப்படுகிறது.

கே: ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல், தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்திறன் மற்றும் பெருக்க செயல்திறன் ஆகியவை சோதனை முடிவுகளை பாதிக்குமா?
கே: மாதிரி சேமிப்பகம், பிரித்தெடுத்தல் எதிர்வினைகள், தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ரியாஜெண்டுகள் மற்றும் ஒளி கடத்தும் நுகர்பொருட்கள் ஆகியவை சோதனை முடிவுகளை பாதிக்குமா?
கே: சோதனைத் தரவை எந்த முறை மூலம் சரி செய்ய முடியும்?

இந்தச் சிக்கல்களைப் பற்றி, கீழே உள்ள மேம்பட்ட மற்றும் மேம்பட்ட பிரிவுகளில் அவற்றை விரிவாக விவரிப்போம்.
2. மேம்பட்ட அறிவு

நிகழ்நேர ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR ஐப் பொறுத்தவரை, ஒவ்வொரு ஆண்டும் ஆயிரக்கணக்கான அறிவியல் ஆய்வுக் கட்டுரைகள் வெளியிடப்படுகின்றன, அவற்றில் ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR தொழில்நுட்பம் சிறிய எண்ணிக்கையில் இல்லை என்ற உண்மையை நாம் அங்கீகரிக்க வேண்டும்.

ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR பரிசோதனையை அளவிட பொதுவான தரநிலை இல்லை என்றால், முடிவுகள் பரவலாக மாறுபடலாம்.அதே இனத்தின் அதே மரபணுவிற்கு, அதே செயலாக்க முறையுடன், கண்டறிதல் முடிவுகளும் பரவலாக மாறுபடும், மேலும் தாமதமாக வருபவர்களுக்கு அதே முடிவுகளை மீண்டும் செய்வது கடினமாக இருக்கும்.உங்களுக்கு எது சரி எது தவறு என்று யாருக்கும் தெரியாது.

ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR ஒரு ஏமாற்று தொழில்நுட்பம் அல்லது நம்பமுடியாத தொழில்நுட்பம் என்று இது அர்த்தப்படுத்துகிறதா?இல்லை, ஏனெனில் ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR அதிக உணர்திறன் மற்றும் துல்லியமானது, மேலும் ஒரு சிறிய தவறான செயல்பாடு முற்றிலும் எதிர் விளைவுகளை ஏற்படுத்தும்.ஒரு சிறிய இழப்பு ஆயிரம் மைல்கள் தொலைவில் உள்ளது.கட்டுரையின் ஆசிரியர் விமர்சகர்களால் மீண்டும் மீண்டும் சித்திரவதை செய்யப்படலாம்.அதே நேரத்தில், பத்திரிகையின் மதிப்பாய்வாளர்கள் வெவ்வேறு சோதனை முடிவுகளிலிருந்து தேர்வு செய்வது கடினம்.

மொத்தத்தில், நிகழ்நேர PCR சோதனைகளில் ஒருமித்த கருத்து இல்லாததை சுட்டிக்காட்டுகிறது.இந்த நோக்கத்திற்காக, தொழில்துறையில் மூத்த விஞ்ஞானிகள் தரநிலைகளை உருவாக்கத் தொடங்கினர்,இந்த தரநிலைகளை பூர்த்தி செய்ய கட்டுரையில் தேவையான சில சோதனை மற்றும் தரவு செயலாக்க விவரங்களை (தேவையான தரவு உட்பட) வழங்க பங்களிப்பாளர்கள் தேவை.

மதிப்பாய்வாளர்கள் இந்த விவரங்களைப் படிப்பதன் மூலம் பரிசோதனையின் தரத்தை மதிப்பிடலாம்;எதிர்கால வாசகர்களும் இதைப் பயன்படுத்தி பரிசோதனையை மீண்டும் செய்யலாம் அல்லது பரிசோதனையை மேம்படுத்தலாம்.இந்த வழியில் பெறப்பட்ட சோதனை முடிவுகள் தகவல், உயர் தரம் மற்றும் பயன்படுத்தக்கூடியவை.

MIBBI (உயிரியல் மற்றும் உயிரியல் மருத்துவ ஆய்வுகளுக்கான குறைந்தபட்ச தகவல் -http://www.mibbi.org) உருவானது.MIBBI என்பது சோதனைகளுக்கான தரநிலைகளை வழங்கும் திட்டமாகும்.இது இயற்கையில் வெளியிடப்பட்டது.இந்தத் திட்டம் செல் உயிரியல், மைக்ரோஅரே, qPCR உள்ளிட்ட பல்வேறு உயிரியல் பரிசோதனைகளை இலக்காகக் கொண்டது, மேலும் நாம் இப்போது விவாதிக்கப் போகிறோம், மேலும் கையெழுத்துப் பிரதிகளை சமர்ப்பிக்கும் போது ஒவ்வொரு வகையான பரிசோதனையையும் வழங்குகிறது.அந்தத் தகவல் எல்லா நேரங்களிலும் வழங்கப்பட வேண்டும்.

MIBBI திட்டத்தில், ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR தொடர்பான இரண்டு கட்டுரைகள் உள்ளன, அதாவது:
·RDML (நிகழ்நேர PCR தரவு மார்க்அப் மொழி) - நிகழ்நேர அளவு PCR தரவுகளுக்கான கட்டமைக்கப்பட்ட மொழி மற்றும் அறிக்கையிடல் வழிகாட்டி;
·MIQE (அளவு நிகழ்நேர PCR பரிசோதனைகளை வெளியிடுவதற்கான குறைந்தபட்ச தகவல்) - நிகழ்நேர அளவு PCR சோதனைகள் பற்றிய கட்டுரைகளை வெளியிடுவதற்கான குறைந்தபட்ச தகவல்.
முதலில், RDML, சொற்பொழிவு விவரக்குறிப்பு பற்றி பேசலாம்.

எல்லாவற்றிற்கும் நிலையான வரையறை இல்லை என்றால், விவாதத்தைத் தொடர முடியாது, அதனால்தான் தேர்வில் விதிமுறைகளின் விளக்கம் மிகவும் முக்கியமானது.
ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR பரிசோதனையில் பயன்படுத்தப்படும் சொற்கள் பின்வரும் உள்ளடக்கத்தை உள்ளடக்கியது.QIAGEN எங்களுக்காக சிறந்த சுருக்கத்தை உருவாக்கியுள்ளது.பின்வருபவை அனைத்தும் உலர்ந்தவைபொருட்கள் .

பெருக்க வளைவு
பெருக்க வளைவு என்பது பிசிஆர் செயல்பாட்டின் போது உருவாக்கப்பட்ட வளைவைக் குறிக்கிறது, சுழற்சி எண்ணை அப்சிசாவாகவும், வினையின் போது நிகழ்நேர ஒளிரும் தீவிரத்தை ஆர்டினேட்டாகவும் கொண்டுள்ளது.

ஒரு சிறந்த பெருக்க வளைவு பின்வரும் பண்புகளைக் கொண்டிருக்க வேண்டும்: அடிப்படையானது தட்டையானது அல்லது சற்று குறைந்துள்ளது, மேலும் வெளிப்படையான மேல்நோக்கிய போக்கு இல்லை;வளைவின் ஊடுருவல் புள்ளி தெளிவாக உள்ளது, மேலும் அதிவேக கட்டத்தின் சாய்வு பெருக்க செயல்திறனுக்கு விகிதாசாரமாகும்.அதிக சாய்வு, அதிக பெருக்க திறன்;ஒட்டுமொத்த பெருக்க வளைவு இணைநிலை நன்றாக உள்ளது, ஒவ்வொரு குழாயின் பெருக்க திறன் ஒத்ததாக இருப்பதைக் குறிக்கிறது;குறைந்த செறிவு மாதிரிகளின் பெருக்க வளைவின் அதிவேக கட்டம் தெளிவாக உள்ளது.

அடிப்படை (அடிப்படை)
அடிப்படையானது ஆரம்ப சுழற்சியின் இரைச்சல் நிலை, பொதுவாக 3வது மற்றும் 15வது சுழற்சிக்கு இடையில் அளவிடப்படுகிறது, ஏனெனில் பெருக்கத் தயாரிப்பால் ஏற்படும் ஃப்ளோரசன் மதிப்பு அதிகரிப்பு இந்தக் காலகட்டத்தில் கண்டறியப்பட முடியாது.அடிப்படைக் கணக்கைக் கணக்கிடப் பயன்படுத்தப்படும் சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை மாறுபடலாம் மற்றும் அதிக டெம்ப்ளேட் அளவுகள் பயன்படுத்தப்பட்டால் அல்லது இலக்கு மரபணுவின் வெளிப்பாடு நிலை அதிகமாக இருந்தால் குறைக்கப்பட வேண்டியிருக்கும்.

அடிப்படையை அமைப்பதற்கு நேரியல் பெருக்க வளைவில் இருந்து ஒளிரும் தரவைப் பார்க்க வேண்டும்.பெருக்க வளைவின் வளர்ச்சியானது அடிப்படை சுழற்சியின் மேல் எண்ணை விட அதிகமான சுழற்சி எண்ணுடன் தொடங்கும் வகையில் அடிப்படை அமைக்கப்பட்டுள்ளது.ஒவ்வொரு இலக்கு வரிசைக்கும் தனித்தனியாக அடிப்படைகள் அமைக்கப்பட வேண்டும்.ஆரம்ப சுழற்சிகளில் கண்டறியப்பட்ட சராசரி ஒளிரும் மதிப்புகள் பெருக்கப்பட்ட தயாரிப்புகளில் பெறப்பட்ட ஒளிரும் மதிப்புகளிலிருந்து கழிக்கப்பட வேண்டும்.பல்வேறு நிகழ்நேர PCR மென்பொருளின் சமீபத்திய பதிப்புகள் தனிப்பட்ட மாதிரிகளுக்கான அடிப்படை அமைப்புகளை தானியங்கு முறையில் மேம்படுத்த அனுமதிக்கின்றன.

PCR பெருக்க வினையின் முதல் சில சுழற்சிகளின் போது, ​​ஃப்ளோரசன் சிக்னல் பெரிதாக மாறாது.ஒரு நேர்கோட்டை அணுகுவது அடிப்படைக் கோடு என்று அழைக்கப்படுகிறது, ஆனால் முதல் சில சுழற்சிகளை நாம் கூர்ந்து கவனித்தால், கீழே உள்ள படத்தில் என்ன நடக்கிறது என்பதை அடிப்படைக் கோட்டிற்குள் காணலாம்.

பின்னணி பின்னணி குறிக்கிறது
எதிர்வினையில் குறிப்பிடப்படாத ஒளிரும் மதிப்பு.உதாரணமாக: திறனற்ற ஃப்ளோரசன்ஸ் தணித்தல்;அல்லது SYBR பசுமையின் பயன்பாட்டினால் அதிக எண்ணிக்கையிலான இரட்டை இழைகள் கொண்ட DNA வார்ப்புருக்கள்.சிக்னலின் பின்னணி கூறுகள் நிகழ்நேர PCR மென்பொருள் அல்காரிதம் மூலம் கணித ரீதியாக அகற்றப்படுகின்றன.

நிருபர் சமிக்ஞை
ரிப்போர்ட்டர் சிக்னல் என்பது SYBR க்ரீன் அல்லது ஃப்ளோரசன்ட் லேபிளிடப்பட்ட வரிசை-குறிப்பிட்ட ஆய்வுகளால் நிகழ்நேர PCR மூலம் உருவாக்கப்பட்ட ஒளிரும் சமிக்ஞையைக் குறிக்கிறது.

நார்மலைஸ்டு ரிப்போர்ட்டர் சிக்னல் (ஆர்என்)
ஒவ்வொரு சுழற்சியிலும் அளவிடப்படும் செயலற்ற குறிப்பு சாயத்தின் ஒளிரும் தீவிரத்தால் வகுக்கப்படும் நிருபர் சாயத்தின் ஒளிரும் தீவிரத்தை RN குறிக்கிறது.

செயலற்ற குறிப்பு சாயம்
சில நிகழ்நேர PCRகளில்,ஃப்ளோரசன்ட் சாயம் ROX என்பது ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னலை இயல்பாக்க உள் குறிப்பாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது..இது தவறான குழாய்கள், கிணறு நிலை மற்றும் ஃப்ளோரசன்ஸ் ஏற்ற இறக்கங்கள் ஆகியவற்றின் காரணமாக ஏற்படும் மாறுபாடுகளை நன்கு சரிசெய்கிறது.

ஃப்ளோரசன்ஸ் வாசல் (வாசல்)
பின்னணி மதிப்பிற்கு மேலேயும், பெருக்க வளைவின் பீடபூமி மதிப்பிற்குக் கீழேயும் சரி செய்யப்பட்டது.இது பெருக்க வளைவின் நேரியல் பகுதியில் இருக்க வேண்டும், இது PCR கண்டறிதலின் பதிவு-நேரியல் வரம்பைக் குறிக்கிறது.பதிவு-பெருக்க வளைவு பார்வையில் நுழைவாயில்கள் அமைக்கப்பட வேண்டும், இதனால் PCR இன் பதிவு-நேரியல் கட்டத்தை எளிதில் அடையாளம் காண முடியும்.நிகழ்நேர PCR இல் பல இலக்கு மரபணுக்கள் இருந்தால், ஒவ்வொரு இலக்கிற்கும் வரம்பு அமைக்கப்பட வேண்டும்.பொதுவாக, PCR எதிர்வினையின் முதல் 15 சுழற்சிகளின் ஒளிரும் சமிக்ஞையானது ஃப்ளோரசன்ஸ் பின்னணி சமிக்ஞையாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் ஃப்ளோரசன்ஸ் த்ரெஷோல்ட் என்பது PCR இன் முதல் 3 முதல் 15 சுழற்சிகளின் ஒளிரும் சமிக்ஞையின் நிலையான விலகலை விட 10 மடங்கு அதிகமாகும்.பொதுவாக, ஒவ்வொரு கருவியும் பயன்பாட்டிற்கு முன் அதன் ஒளிரும் வாசல் அமைக்கப்பட்டுள்ளது.

சுழற்சி வாசல் (CT) அல்லது கிராசிங் பாயிண்ட் (CP)
பெருக்க வளைவு வாசலைக் கடக்கும் சுழற்சி (அதாவது, ஃப்ளோரசன்ஸ் கண்டறிதல் கணிசமாக அதிகரிக்கும் புள்ளி).CT ஒரு பின்னமாக இருக்கலாம் மற்றும் தொடக்க டெம்ப்ளேட்டின் அளவைக் கணக்கிடலாம்.CT மதிப்பு ஒவ்வொரு PCR எதிர்வினை குழாயிலும் உள்ள ஒளிரும் சமிக்ஞை செட் வாசலை அடையும் போது ஏற்படும் சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையைக் குறிக்கிறது.ஒவ்வொரு டெம்ப்ளேட்டின் CT மதிப்புக்கும், வார்ப்புருவின் ஆரம்ப நகல் எண்ணின் மடக்கைக்கும் இடையே ஒரு நேரியல் தொடர்பு உள்ளது.ஆரம்ப நகல் எண் அதிகமாகும், CT மதிப்பு சிறியது, மற்றும் நேர்மாறாகவும்.அறியப்பட்ட ஆரம்ப நகல் எண்ணைக் கொண்ட ஒரு தரநிலையைப் பயன்படுத்தி ஒரு நிலையான வளைவை உருவாக்கலாம், இதில் abscissa CT மதிப்பைக் குறிக்கிறது, மேலும் ஆர்டினேட் ஆரம்ப நகல் எண்ணின் மடக்கையைக் குறிக்கிறது.எனவே, தெரியாத மாதிரியின் CT மதிப்பு பெறப்படும் வரை, மாதிரியின் ஆரம்ப நகல் எண்ணை நிலையான வளைவில் இருந்து கணக்கிட முடியும்.

ΔCT மதிப்பு
ΔCT மதிப்பு விவரிக்கிறதுஇலக்கு மரபணு மற்றும் தொடர்புடைய எண்டோஜெனஸ் குறிப்பு மரபணு CT மதிப்பு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான வேறுபாடு, ஹவுஸ் கீப்பிங் மரபணு போன்றவை, பயன்படுத்தப்படும் டெம்ப்ளேட்டின் அளவை இயல்பாக்கப் பயன்படுகிறது:
⇒ΔCT = CT (இலக்கு மரபணு) - CT (உள்ளுறுப்பு குறிப்பு மரபணு)

ΔΔCT மதிப்பு
ΔΔCT மதிப்பு வட்டி மாதிரியின் சராசரி ΔΔCT மதிப்புக்கும் (எ.கா. தூண்டப்பட்ட செல்கள்) மற்றும் குறிப்பு மாதிரியின் சராசரி ΔΔCT மதிப்புக்கும் (எ.கா. தூண்டப்படாத செல்கள்) உள்ள வித்தியாசத்தை விவரிக்கிறது.குறிப்பு மாதிரியானது அளவுத்திருத்த மாதிரி என்றும் அழைக்கப்படுகிறது மற்றும் மற்ற அனைத்து மாதிரிகளும் ஒப்பீட்டு அளவீட்டிற்காக இயல்பாக்கப்படுகின்றன:
⇒ΔΔCT = சராசரி ΔCT (விருப்பத்தின் மாதிரி) - சராசரி ΔCT (குறிப்பு மாதிரி)

எண்டோஜெனஸ் குறிப்பு மரபணுக்கள்
வீட்டு பராமரிப்பு மரபணுக்கள் (ஹவுஸ் கீப்பிங் ஜீன்கள்) போன்ற எண்டோஜெனஸ் குறிப்பு மரபணுக்களின் வெளிப்பாடு நிலைகள் மாதிரிகளுக்கு இடையில் வேறுபடுவதில்லை.குறிப்பு மரபணுவின் CT மதிப்புகளை இலக்கு மரபணுவுடன் ஒப்பிடுவது, இலக்கு மரபணுவின் வெளிப்பாடு அளவை உள்ளீடு RNA அல்லது cDNA அளவுக்கு இயல்பாக்க அனுமதிக்கிறது (மேலே உள்ள ΔCT மதிப்புகளின் பகுதியைப் பார்க்கவும்).

உள் குறிப்பு மரபணுக்கள் சரியானவைசாத்தியமான RNA சிதைவு அல்லது RNA மாதிரிகளில் என்சைம் தடுப்பான்கள் இருப்பது, அத்துடன் RNA உள்ளடக்கத்தில் மாறுபாடுகள், தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் திறன், நியூக்ளிக் அமிலம் மீட்பு மற்றும் மாதிரி கையாளுதல்.உகந்த குறிப்பு மரபணு(களை) தேர்ந்தெடுக்க, சோதனை அமைப்பைச் சார்ந்து உகந்த குறிப்பைத் தேர்ந்தெடுப்பதை அனுமதிக்கும் வகையில் அல்காரிதத்தை மாற்றியுள்ளோம்.

உள் கட்டுப்பாடு
இலக்கு வரிசையின் அதே எதிர்வினையில் பெருக்கப்படும் மற்றும் வேறுபட்ட ஆய்வு மூலம் ஆய்வு செய்யப்படும் ஒரு கட்டுப்பாட்டு வரிசை (அதாவது, டூப்ளக்ஸ் பிசிஆர் செயல்திறன்).இலக்கு வரிசை கண்டறியப்படாதபோது, ​​தோல்வியுற்ற பெருக்கங்களை நிராகரிக்க, உள் கட்டுப்பாடுகள் பெரும்பாலும் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.
அளவுத்திருத்த மாதிரி
ஒரு குறிப்பு மாதிரி (உதாரணமாக, ஒரு செல் கோடு அல்லது திசுக்களில் இருந்து சுத்திகரிக்கப்பட்ட RNA) ஒரு மரபணுவின் ஒப்பீட்டு வெளிப்பாடு அளவை தீர்மானிக்க மற்ற அனைத்து மாதிரிகளையும் ஒப்பிடுவதற்கு ஒப்பீட்டு அளவீட்டில் பயன்படுத்தப்படுகிறது.அளவுத்திருத்த மாதிரியானது எந்த மாதிரியாகவும் இருக்கலாம், ஆனால் இது பொதுவாக ஒரு கட்டுப்பாடு (உதாரணமாக, சிகிச்சை அளிக்கப்படாத மாதிரி அல்லது பரிசோதனையின் பூஜ்ஜியத்திலிருந்து மாதிரி).

நேர்மறை கட்டுப்பாடுகள்
உடன் கட்டுப்பாட்டு எதிர்வினைகளைப் பயன்படுத்தவும்வார்ப்புருவின் அறியப்பட்ட அளவுகள்.ஒரு ப்ரைமர் செட் அல்லது ப்ரைமர்-புரோப் செட் சரியாக வேலை செய்கிறதா மற்றும் எதிர்வினை சரியாக அமைக்கப்பட்டதா என்பதைச் சரிபார்க்க நேர்மறை கட்டுப்பாடுகள் பெரும்பாலும் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.

டெம்ப்ளேட் கட்டுப்பாடு இல்லை (NTC)
வார்ப்புருவைத் தவிர பெருக்க வினையின் தேவையான அனைத்து கூறுகளையும் கொண்ட ஒரு கட்டுப்பாட்டு எதிர்வினை, இது வழக்கமாக தண்ணீரால் மாற்றப்படுகிறது.என்டிசியின் பயன்பாடு, ரியாஜெண்ட் மாசுபாடு அல்லது வெளிநாட்டு டிஎன்ஏவால் ஏற்படும் மாசுபாட்டைக் கண்டறியலாம், இதனால் கண்டறிதல் தரவின் நம்பகத்தன்மை மற்றும் நம்பகத்தன்மையை உறுதி செய்கிறது.NTC கட்டுப்பாட்டின் பெருக்கம் மாசுபாட்டைக் குறிக்கிறது.

RT கட்டுப்பாடு இல்லை (NRT)
ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல் செயல்பாட்டில் எஞ்சிய மரபணு டிஎன்ஏ இருக்கலாம், இது மிகவும் தீங்கு விளைவிக்கும் மற்றும் தரவு தரத்தை பாதிக்கும் குற்றவாளி மற்றும் qPCR இன் இயற்கை எதிரி, எனவே சோதனைகளை வடிவமைக்கும் போது, ​​அது RNA கண்டறிதலை பெருக்கும் வகையில் வடிவமைக்கப்பட வேண்டும்.இரண்டு வழிகள் உள்ளன, ஒன்று இன்ட்ரான் முழுவதும் ப்ரைமர்களை வடிவமைப்பது, மற்றொன்று டிஎன்ஏவை முழுவதுமாக அகற்றுவது, எது சிறந்தது, இது பின்னர் விவாதிக்கப்படும்.என்டிஆர் கட்டுப்பாடு என்பது டிஎன்ஏ மாசுபாட்டைக் கண்டறியும் ஒரு மாயக் கண்ணாடி.பெருக்கம் இருந்தால், மாசு உள்ளது என்று அர்த்தம்.

தரநிலைகள்
தரநிலைகள் என்பது ஒரு நிலையான வளைவை உருவாக்கப் பயன்படுத்தப்படும் அறியப்பட்ட செறிவு அல்லது நகல் எண்ணின் மாதிரிகள்.தரநிலையின் நிலைத்தன்மையை உறுதி செய்வதற்காக, மரபணு துண்டு பொதுவாக பிளாஸ்மிட்டில் குளோன் செய்யப்பட்டு தரமாக பயன்படுத்தப்படுகிறது.

நிலையான வளைவு
வழக்கமாக இரட்டிப்பு விகிதத்தின்படி நிலையான தயாரிப்புடன் குறைந்தபட்சம் 5 செறிவு சாய்வுகளில் நீர்த்தப்படுகிறது, மேலும் CT மதிப்பு மற்றும் நகல் எண்ணின் ஆயத்தொலைவுகளில் 5 புள்ளிகள் வரையப்படுகின்றன, மேலும் நிலையான வளைவை உருவாக்க புள்ளிகள் ஒரு வரியை உருவாக்க இணைக்கப்படுகின்றன.ஒவ்வொரு நிலையான வளைவுக்கும், அதன் செல்லுபடியை சரிபார்க்க வேண்டும்.சாய்வு மதிப்பு –3.3 மற்றும் –3.8 க்கு இடையில் குறைகிறது, மேலும் ஒவ்வொரு செறிவும் மும்மடங்காக செய்யப்படுகிறது.மற்ற புள்ளிகளிலிருந்து கணிசமாக வேறுபட்ட புள்ளிகள் நிராகரிக்கப்பட வேண்டும்.பரிசோதிக்கப்பட வேண்டிய மாதிரியின் CT மதிப்பு நிலையான வளைவுக்குள் கொண்டு வரப்படுகிறது, மேலும் சோதிக்கப்பட வேண்டிய மாதிரியின் வெளிப்பாடு அளவைக் கணக்கிடலாம்.

பரிசோதிக்கப்பட வேண்டிய மாதிரியின் CT மதிப்பு நிலையான வளைவில் கொண்டு வரப்படுகிறது, மேலும் சோதிக்கப்பட வேண்டிய மாதிரியின் ஆரம்ப நகல் எண்ணைக் கணக்கிடலாம்.

செயல்திறன் மற்றும் சாய்வு
நிலையான வளைவின் சாய்வு நிகழ்நேர PCR இன் செயல்திறனைக் குறிக்கிறது.
·-3.322 இன் சாய்வானது PCR பெருக்க திறன் 1 அல்லது 100% செயல்திறன் மற்றும் ஒவ்வொரு சுழற்சியிலும் PCR தயாரிப்பின் அளவு இரட்டிப்பாகும் என்பதைக் குறிக்கிறது.
-3.322 (எ.கா. –3.8) க்கும் குறைவான சாய்வு PCR செயல்திறனைக் குறிக்கிறது
ஒரு சாய்வு –3.322 (எ.கா. –3.0) ஐ விட அதிகமாக இருந்தால், PCR செயல்திறன் 100% க்கும் அதிகமாக இருப்பதாகத் தோன்றுகிறது, இது ஆர்வமாக உள்ளது, PCR இன் ஒரு சுழற்சி எவ்வாறு பெருக்கப்பட்ட தயாரிப்பை விட இரண்டு மடங்கு அதிகமாக உருவாக்க முடியும்?இந்த நிலைமை பிசிஆர் எதிர்வினையின் நேரியல் அல்லாத கட்டத்தில் நிகழ்கிறது, அதாவது, அதிக அளவு குறிப்பிடப்படாத பெருக்கம் உள்ளது.

உருகும் வளைவு
qPCR பெருக்கம் முடிந்ததும், PCR தயாரிப்பு சூடாகிறது.வெப்பநிலை உயரும் போது, ​​இரட்டை இழை பெருக்க தயாரிப்பு படிப்படியாக உருகுகிறது, இதன் விளைவாக ஒளிரும் தீவிரம் குறைகிறது.ஒரு குறிப்பிட்ட வெப்பநிலையை (டிஎம்) அடைந்தால், அதிக எண்ணிக்கையிலான பொருட்கள் உருகும்.ஃப்ளோரசன்ஸ் கூர்மையாக குறைகிறது.வெவ்வேறு PCR தயாரிப்புகள் வெவ்வேறு Tm மதிப்புகள் மற்றும் வெவ்வேறு உருகும் வெப்பநிலைகளைக் கொண்டுள்ளன, இதனால் PCR இன் தனித்தன்மையை அடையாளம் காண முடியும்.

உருகும் வளைவு (வழித்தோன்றல் வளைவு)
உருகும் வளைவு ஒரு உச்ச வரைபடத்தை உருவாக்க பெறப்பட்டது, இது PCR தயாரிப்பு துண்டுகளின் நிலைமையை மிகவும் உள்ளுணர்வாகக் காண்பிக்கும்.உருகும் வெப்பநிலையானது டிஎன்ஏ துண்டின் டிஎம் மதிப்பாக இருப்பதால், டிஎன்ஏ துண்டின் டிஎம் மதிப்பைப் பாதிக்கும் சில அளவுருக்கள், துண்டு அளவு, ஜிசி உள்ளடக்கம் போன்றவற்றை மதிப்பிடலாம். பொதுவாக, எங்கள் முதன்மை வடிவமைப்பு கொள்கைகளின்படி,பெருக்கப்பட்ட உற்பத்தியின் நீளம் 80-300bp வரம்பில் உள்ளது, எனவே உருகும் வெப்பநிலை 80 ° C மற்றும் 90 ° C க்கு இடையில் இருக்க வேண்டும்.

உருகும் வளைவின் விளக்கம்: ஒரே முக்கிய உச்சம் 80°C-90°C வரை தோன்றினால், அது ஒளிரும் அளவு PCR சரியானது என்று அர்த்தம்;பிரதான உச்சம் 80°C-90°C க்கும், இதர சிகரங்கள் 80°Cக்குக் கீழும் தோன்றினால், முதன்மையான டைமர் அடிப்படையில் கருதப்படுகிறது.அதைத் தீர்க்க நீங்கள் அனீலிங் வெப்பநிலையை அதிகரிக்க முயற்சி செய்யலாம்;பிரதான உச்சம் 80°C-90°C க்கு இடையில் தோன்றி, வெப்பநிலை அதிகரிக்கும் போது இதர உச்சம் மீண்டும் தோன்றினால், DNA மாசுபாடு இருப்பதாகக் கருதப்படுகிறது, மேலும் சோதனையின் ஆரம்ப கட்டத்தில் DNA அகற்றப்பட வேண்டும்.

நிச்சயமாக, இன்னும் சில அசாதாரண சூழ்நிலைகள் உள்ளன, அவை ஒவ்வொன்றாக கீழே பிரிக்கப்படும்.
3. மேம்பட்ட அறிவு

qPCR செய்ய, நான் MIQE என்று சொல்ல வேண்டும்,குறைந்தபட்ச தகவல்வெளியீட்டிற்காகஅளவுநிகழ்நேர பி.சி.ஆர்சோதனைகள் —நிகழ் நேர அளவு PCR பற்றிய கட்டுரைகளை வெளியிடுவதற்கான குறைந்தபட்ச தகவல்சோதனைகள்.அனைவரின் புரிதலையும் எளிமையாக்கும் வகையில், முக்கிய உள்ளடக்கத்தை எளிமைப்படுத்துவோம்.

இணையத்தில் MIQE இன் அசல் உரையை நீங்கள் தேடலாம், மேலும் மிக முக்கியமான விஷயம் என்னவென்றால்,ஒரு கட்டுரையை வெளியிடும் போது வழங்க வேண்டிய தரவு சரிபார்ப்பு பட்டியல் .

மதிப்பாய்வாளர்கள் இந்த விவரங்களைப் படிப்பதன் மூலம் பரிசோதனையின் தரத்தை மதிப்பிடலாம்;எதிர்கால வாசகர்களும் சோதனையை மீண்டும் செய்ய அல்லது மேம்படுத்த இதைப் பயன்படுத்தலாம்.
இந்த பட்டியலில், ஒவ்வொரு பட்டியலின் முக்கியத்துவமும் முறையே E அல்லது D என குறிக்கப்பட்டுள்ளது என்பது குறிப்பிடத்தக்கது.இதற்கு என்ன அர்த்தம்?இ: அத்தியாவசியத் தகவல் (சமர்ப்பிக்கப்பட வேண்டும்);டி: விரும்பத்தக்க தகவல் (முடிந்தவரை வழங்கவும்).

MIQE (1)-பரிசோதனை வடிவமைப்பு
பட்டதாரி படிப்பை முடித்த பிறகு, தங்கள் பாதுகாப்பை முடித்த பல முட்டாள்கள், ஒரு பரிசோதனையை சுயாதீனமாக வடிவமைக்கவும், தங்கள் குறிப்பேடுகளைத் திறக்கவும், ஆசிரியர் சொல்வதைச் செய்யவும் தெரியாது.இதன் விளைவாக, சோதனை வடிவமைப்பு கடுமையாக இல்லை, மேலும் இந்த படத்தையும் அந்த படத்தையும் உருவாக்க விரும்புவதாக பத்திரிகையின் ஆசிரியர் பிரிவு கூறியது, எனவே அவர்கள் அதை மயக்கத்தில் செய்தார்கள்.இப்படித்தான் கசடுகள் உருவாக்கப்படுகின்றன!

வீட்டிற்கு அருகில், பரிசோதனையின் முதல் கொள்கை தீர்மானிக்க வேண்டும்சோதனை தர்க்கத்தின் கடுமை.மிகவும் அடிப்படையான விஷயம் சோதனை வடிவமைப்பு ஆகும், மேலும் சோதனை வடிவமைப்பின் மிக முக்கியமான விஷயம், இலக்கு மாதிரி, குறிப்பு மாதிரி (கட்டுப்பாடு) மற்றும் மறுபரிசீலனைகளின் எண்ணிக்கையை எவ்வாறு அமைப்பது என்பதுதான், இதனால் சோதனைத் தரவைக் குறிப்பிடலாம், ஒப்பிடலாம் மற்றும் நம்பத்தகுந்ததாக இருக்கும்.

இலக்கு மாதிரிஒரு குறிப்பிட்ட சிகிச்சைக்குப் பிறகு இலக்கு மரபணுவைக் கண்டறிய நமக்குத் தேவைப்படும் மாதிரியைக் குறிக்கிறது.குறிப்பு மாதிரிஎந்த சிகிச்சையும் இல்லாத மாதிரி, இது பெரும்பாலும் உயிரியலில் காட்டு வகை என குறிப்பிடப்படுகிறது.

சோதனைப் பிரதிகள்மிக முக்கியமானவை.பொதுவாக, வற்புறுத்தும் பிரதிகளின் எண்ணிக்கை மூன்றுக்கும் அதிகமாக இருக்க வேண்டும்.உயிரியல் நகலெடுப்பு என்றால் என்ன மற்றும் தொழில்நுட்ப பிரதிகள் என்ன என்பதை வேறுபடுத்துவது அவசியம்.

உயிரியல் பிரதிகள்: வெவ்வேறு பொருட்களுடன் (நேரம், தாவரங்கள், தொகுதிகள், எதிர்வினை தகடுகள்) செய்யப்பட்ட அதே சரிபார்ப்பு சோதனை.

உயிரியல் நகல்
மிளகாயின் பூச்சிக்கொல்லி மருந்தை உதாரணமாக எடுத்துக் கொள்வோம்.ஏபிசியின் மூன்று தாவரங்களில் பூச்சிக்கொல்லிகளை தெளிக்க விரும்புகிறோம், பின்னர் ஏபிசியின் மூன்று தாவரங்கள் மூன்று உயிரியல் பிரதிகள், மேலும் அவை வெவ்வேறு பொருட்களால் மேற்கொள்ளப்பட்ட அதே சரிபார்ப்பு பரிசோதனையாகும்.ஆனால் ஒரு பரிசோதனையாக, கண்டிப்பாக ஒரு கட்டுப்பாடு தேவை, எனவே தாவர A இன் ஒரு சோதனை குழுவை உருவாக்க தாவர A இன் கிளைகளில் ஒன்றை தெளிக்கலாம், மேலும் ஒரு கட்டுப்பாட்டு குழுவை உருவாக்க தாவர A இன் மற்ற கிளைகளை தெளிக்கக்கூடாது.B மற்றும் C க்கும் அவ்வாறே செய்யுங்கள்.

தொழில்நுட்ப பிரதிகள் (தொழில்நுட்ப பிரதிகள்): இது செயல்பாட்டினால் ஏற்படும் பிழைகளைத் தவிர்ப்பதற்காக வடிவமைக்கப்பட்ட ஒரு தொடர்ச்சியான பரிசோதனையாகும், இது உண்மையில் அதே பொருளில் சேர்க்கப்பட்டுள்ள நகல் துளை ஆகும்.சிகிச்சைகள் மற்றும் கட்டுப்பாடுகள் இரண்டும் இலக்கு மரபணு மற்றும் உள் குறிப்பு மரபணுவின் பிரதி அமைப்புகளை (குறைந்தபட்சம் மூன்று) கொண்டிருக்க வேண்டும்.

தொழில்நுட்ப மறுபடியும்
பூச்சிக்கொல்லி மருந்து அடிக்கப்பட்ட மிளகாயை மீண்டும் உதாரணமாக எடுத்துக் கொள்ளுங்கள்.தாவர A இன் சோதனைக் குழுவிற்கு, அதன் இலக்கு மரபணு மற்றும் உள் குறிப்பு மரபணுக்களுக்கு முறையே 1, 2 மற்றும் 3 இன் மூன்று PCR துளைகளை உருவாக்கினோம், எனவே கண்டறிதலுக்குப் பிறகு சராசரியை எடுக்க வேண்டும்.தாவரத்தின் கட்டுப்பாட்டிற்கு A குழுக்கள் அதே வழியில் நடத்தப்படுகின்றன.இதேபோல், பி மற்றும் சி தாவரங்களுக்கும் அதே சிகிச்சையை செய்யுங்கள்.இது தொழில்நுட்ப மறுநிகழ்வு.

என்பது குறிப்பிடத்தக்கதுபுள்ளிவிவரங்களில் நுழைவது உயிரியல் மறுபரிசீலனை ஆகும், மேலும் தொழில்நுட்ப மறுபரிசீலனை என்பது சோதனைச் செயல்பாட்டில் ஏதேனும் சீரற்ற நிகழ்வுகள் உள்ளதா என்பதைச் சோதிப்பதாகும், இதனால் சோதனை முடிவுகளை நம்பத்தகுந்ததாக ஆக்க வேண்டும், அதாவது, நாம் அடிக்கடி சொல்வது போல் அவற்றின் சராசரியை எடுத்து பிழைகளைத் தவிர்க்க வேண்டும்.

எதிர்மறை கட்டுப்பாடுகள்-NTC மற்றும் NRT
NTC (டெம்ப்ளேட் கட்டுப்பாடு இல்லை), டெம்ப்ளேட் இல்லாத கட்டுப்பாடு, சோதனைப் பொருள் மாசுபட்டதா என்பதைச் சரிபார்க்கப் பயன்படுகிறது.பொதுவாக, நீர் ஒரு டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.ஒரு ஃப்ளோரசன்ட் எதிர்வினை இருந்தால், ஆய்வகத்தில் நியூக்ளிக் அமிலம் மாசுபட்டுள்ளது என்பதைக் குறிக்கிறது.

இந்த மாசுகள் இருந்து வருகின்றன: அசுத்த நீர், எண்டோஜெனஸ் டிஎன்ஏ, ப்ரைமர் மாசுபாடு, ஆய்வக உபகரண மாசுபாடு, ஏரோசல் மாசுபாடு போன்றவற்றைக் கொண்ட தகுதியற்ற எதிர்வினைகள், RNase ஸ்காவெஞ்சர்கள் மற்றும் RNase தடுப்பான்களைப் பயன்படுத்த வேண்டும்.ஏரோசல் மாசுபாட்டைக் கண்டுபிடிப்பது மிகவும் கடினம்.பல்வேறு நியூக்ளிக் அமிலங்கள் காற்றில் இடைநிறுத்தப்பட்ட நிலையில், உங்கள் ஆய்வகம் புகை போன்றது என்று கற்பனை செய்து பாருங்கள்.

NRT (நோ-ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ்), தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் இல்லாத கட்டுப்பாடு, எதிர்மறையான கட்டுப்பாட்டாக தலைகீழாக டிரான்ஸ்கிரிப்ட் செய்யப்பட்ட RNA ஆகும், இது gDNA எச்சத்தின் கட்டுப்பாட்டாகும்.

மரபணு வெளிப்பாட்டைச் செய்யும்போது, ​​ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்குப் பிறகு சிடிஎன்ஏ அளவைக் கண்டறிவதன் மூலம் ஆர்என்ஏவின் அளவு கண்டறியப்படுகிறது.RNA சுத்திகரிக்கப்படும் போது gDNA எச்சம் இருந்தால், அது சோதனை முடிவுகளில் பிழைகளை ஏற்படுத்தும், ஏனெனில் பெறப்பட்ட உண்மையான முடிவுகள் gDNA மற்றும் cDNA ஆகும்.மொத்த அளவில், சிடிஎன்ஏ மட்டுமல்ல, ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுக்கும் போது ஜிடிஎன்ஏ முழுவதுமாக அகற்றப்பட வேண்டும்.

MIQE (2) - மாதிரி தகவல்
மாதிரித் தகவல் என்று அழைக்கப்படுவது, qPCR பற்றிய கட்டுரையை வெளியிடும்போது, ​​மாதிரித் தகவலைத் தெளிவாக விளக்க வேண்டும், இது கட்டுரையின் தவிர்க்க முடியாத பகுதியாகும்.இதேபோல், நாம் மாதிரிகளைச் செயலாக்கும் போது, ​​மாதிரிகளின் செல்லுபடியை உறுதிசெய்ய நமது சொந்த செயல்பாடுகளையும் நாம் ஒழுங்குபடுத்த வேண்டும்.

மாதிரியின் விளக்கம் ஒரு முடிவு மட்டுமே, மேலும் முழு பரிசோதனையின் போது எடுக்கப்பட்ட பொருட்களுக்கு நாம் அதிக கவனம் செலுத்த வேண்டும்.

சோதனை பொருட்களின் தேர்வு
இரத்த மாதிரிகள் - புதிய இரத்தத்தை தேர்வு செய்யவும், 4 மணி நேரத்திற்கு மேல் இல்லை.செல் மாதிரிகள் - தீவிர வளர்ச்சியின் காலகட்டத்தில் புதிய செல்களை சேகரிக்க தேர்வு செய்யவும்.விலங்கு திசு - புதிய, தீவிரமாக வளரும் திசுக்களைத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.தாவர திசு - புதிய, இளம் திசுவை தேர்வு செய்யவும்.

இந்த சில வாக்கியங்களில் ஒரு முக்கிய வார்த்தை இருப்பதை நீங்கள் கவனித்திருப்பீர்கள்: புதியது .
மேலே உள்ள மாதிரிகளுக்கு, சந்தையில் சிறந்த, செலவு குறைந்த மற்றும் நிலையான கிட் Foregene's kit ஆகும், இது விரைவாகவும் எளிதாகவும் அவற்றின் DNA மற்றும் RNA ஐ பிரித்தெடுக்கும்.

இரத்த டிஎன்ஏ மினி கிட்

செல் மொத்த RNA ஐசோலேஷன் கிட்

விலங்கு மொத்த ஆர்என்ஏ தனிமைப்படுத்தல் கிட்

தாவர மொத்த RNA ஐசோலேஷன் கிட்

தாவர மொத்த RNA ஐசோலேஷன் கிட் பிளஸ்

தாவர டிஎன்ஏ ஐசோலேஷன் கிட்

சோதனை பொருட்கள் சேமிப்பு
பொதுவாக, நிபந்தனைகள் அனுமதித்தால், மாதிரிகளை சேமிப்பதை நாங்கள் பரிந்துரைக்க மாட்டோம்.இருப்பினும், மாதிரி எடுத்த உடனேயே பரிசோதனைகளை மேற்கொள்ள முடியாத பல நண்பர்கள் உள்ளனர், மேலும் சிலர் மாதிரி எடுக்க திரவ நைட்ரஜன் தொட்டிகளை களத்திற்கு எடுத்துச் செல்ல வேண்டும்.

இந்த வகையான கடின உழைப்பாளி நண்பருக்கு, நீங்கள் ரீஜெண்ட் நுகர்பொருட்களைப் புரிந்து கொள்ளவில்லை என்று மட்டுமே சொல்ல முடியும்.இப்போது பல ரியாஜென்ட் நுகர்வு நிறுவனங்கள் அறை வெப்பநிலையில் ஆர்என்ஏ மாதிரிகளை சேமிக்கக்கூடிய மறுஉருவாக்கங்களை உற்பத்தி செய்கின்றன, மேலும் அவற்றை நீங்கள் தேர்வு செய்யலாம்.வழக்கமான சேமிப்பு முறை திரவ நைட்ரஜன் சேமிப்பு ஆகும், இது ஒரு சிறிய திரவ நைட்ரஜன் தொட்டியைப் பயன்படுத்துகிறது.மாதிரியை மீண்டும் ஆய்வகத்திற்கு கொண்டு வந்த பிறகு, அதை -80 ° C குளிர்சாதன பெட்டியில் சேமிக்கவும்.

ஆர்.என்.ஏ சம்பந்தப்பட்ட சோதனைகளுக்கு, ஆறு வார்த்தைக் கொள்கையைப் பின்பற்ற வேண்டும்:குறைந்த வெப்பநிலை, நொதிகள் இல்லை,மற்றும்வேகமாக .

குறைந்த வெப்பநிலையின் கருத்து புரிந்து கொள்ள எளிதானது;நொதிகள் இல்லாமல், RNase நாம் வாழும் உலகில் எல்லா இடங்களிலும் உள்ளது (இல்லையெனில் நீங்கள் HIV ஆல் கொல்லப்பட்டிருப்பீர்கள்), எனவே பரிசோதனைகள் செய்யும் போது RNase ஐ எவ்வாறு தவிர்ப்பது என்பது மிக முக்கியமான கருத்தாகும்;வேகமாக,உடைக்க முடியாத குங்ஃபூ உலகில் இல்லை, வேகத்தை மட்டுமே உடைக்க முடியாது.

எனவே, ஒரு வகையில், பிரித்தெடுக்கும் நேரம் குறைவாக இருந்தால், கிட் சிறந்தது.எதனால்முன்னோடிஇன் கிட் வேகத்தை வலியுறுத்துகிறது, ஏனென்றால் அவர்களுக்கு அது நன்றாகத் தெரியும்.

PS: சில பெண்கள் சோதனைகளை மிகவும் கவனமாகச் செய்கிறார்கள், ஆனால் பல வருடங்கள் வேலைக்குப் பிறகு அவர்கள் ஒரு ஸ்லாம் டங்க் போல நன்றாக இல்லை.கடவுள் நியாயமற்றவர், மற்றவர்களைப் பற்றி குறை கூறுகிறார், வாழ்க்கையைத் தேடுகிறார் என்று அவர்கள் உணர்கிறார்கள்.உண்மையில், அவளுக்கு அது புரியவில்லை.அவர் ஆர்என்ஏவை நன்றாகப் பாதுகாக்கவில்லை, மேலும் ஸ்லாம் டங்க் பிளேயர் வேகமானவராக இருந்தார்.பரிசோதனை செய்துகொண்டிருக்கும்போது, ​​ஸ்லாம் டங்கை மூன்று முறை, ஐந்து முறை, இரண்டு பிரிவுகளுடன் முடித்துவிடுவார் என்று நினைத்தார்.ஆனால் பரிசோதனையை சிறப்பாக செய்தார்.

குறிப்பு: மெதுவாக, RNase படையெடுப்பின் அதிக வாய்ப்புகள்.விரைவாக இருக்க உங்களை எவ்வாறு பயிற்றுவிப்பது?வழியில்லை, மேலும் பயிற்சி செய்யுங்கள்.

வெவ்வேறு சோதனைகள் மற்றும் வெவ்வேறு மாதிரிகளுக்கு, இன்னும் அதிகமான இலக்கியங்களைப் படிக்கவும், செயலாக்கத்திற்கான பொருத்தமான முறையைத் தேர்வு செய்யவும் இன்னும் அவசியம்.மாதிரி சேகரிப்பு மற்றும் சேமிப்பக செயல்முறைக்கு, MIQE ஆனது தாளில் தெளிவாக எழுதப்பட்டிருக்க வேண்டும், இதனால் மதிப்பாய்வாளர்கள் தாளின் நம்பகத்தன்மையை மதிப்பாய்வு செய்யலாம், மேலும் திகைத்து நிற்கும் இளைஞர்கள் உங்கள் பரிசோதனையை மீண்டும் செய்ய வசதியாக இருக்கும்.

உயிரியல் பரிசோதனைகள் கடினமானவை என்றாலும், அவை உயர்தரமானவை.கவனமாக இல்லாவிட்டால் உலகையே புரட்டிப் போடலாம்.எடுத்துக்காட்டாக, SARS ஐ உயிர்வேதியியல் நெருக்கடியாக மாற்றுவது அல்லது 1.3 பில்லியன் மக்களைக் காப்பாற்ற கலப்பின அரிசியை உருவாக்குவது.கீழே உள்ள படம் ஒரு இரசாயன பரிசோதனையாகும், அவருடைய டிக் போன்ற தோற்றத்தைப் பார்த்து உங்கள் ஆராய்ச்சியில் நீங்கள் எவ்வளவு பெருமைப்படுகிறீர்கள் என்பதை நீங்கள் புரிந்து கொள்ள வேண்டும்.அதை மறந்துவிடு, அவனை கருப்பாக்காதே.

MIQE (3) - நியூக்ளிக் அமிலம் பிரித்தெடுத்தல்.
நியூக்ளிக் அமிலம் பிரித்தெடுத்தல் ஒரு பெரிய நிகழ்வாகும், மேலும் அனைத்து மூலக்கூறு உயிரியல் சோதனைகளும் நியூக்ளிக் அமிலம் பிரித்தெடுப்பதில் தொடங்குகின்றன.முதலில், நியூக்ளிக் அமிலம் பிரித்தெடுத்தலில் MIQE இன் உள்ளடக்கத்தை நகலெடுப்போம்.

இந்த படிவத்தைப் பார்த்தால், நீங்கள் மேற்பரப்பில் இருக்க முடியாது.வடிவம் ஒரு கோட்பாடு.ஒரு சிறந்த மாணவராக இருக்க, நீங்கள் ஏன் என்று கேட்க வேண்டும்.இந்த அட்டவணையின் அத்தியாவசிய உள்ளடக்கம்: பின்தொடரவும்ஆர்என்ஏவின் தூய்மை, ஒருமைப்பாடு, நிலைத்தன்மை மற்றும் பிரித்தெடுத்தல் அளவு .

முதல் பகுதிசெயல்முறை அல்லது கருவி என்பது நியூக்ளிக் அமிலம் பிரித்தெடுக்கும் படியாகும்.நீங்கள் பிரித்தெடுக்க ஒரு தானியங்கி நியூக்ளிக் அமிலம் பிரித்தெடுக்கும் கருவியைப் பயன்படுத்தினால் (மேம்பட்டது, வாங்குவதற்கு என்னைத் தொடர்பு கொள்ளவும்), நீங்கள் கருவியின் மாதிரி பெயரைக் குறிப்பிட வேண்டும்.

தொகுப்பின் பெயர் மற்றும்

மாற்ற விவரங்களுக்கு என்ன கிட் பயன்படுத்தப்பட்டது, என்ன சிறப்பு எதிர்வினைகள் சேர்க்கப்பட்டன அல்லது என்ன சிறப்பு செயல்பாடுகள் செய்யப்பட்டன என்பதை தெளிவாக விளக்க வேண்டும், இதனால் மற்றவர்கள் உங்கள் பரிசோதனையை எளிதாக மீண்டும் செய்யலாம்.

சிலர் ஸ்பெஷல் சாம்பிள்களை பிரித்தெடுக்கும் போது சில ஸ்பெஷல் ரியாஜெண்டுகளை சேர்த்துக் கொள்கிறார்கள்.அதை ரகசியமாக வைத்திருக்கும் அதே வேளையில், உங்கள் கட்டுரையை ஜொலிக்க வைக்கும் வாய்ப்பையும் இழக்கிறார்கள்.புத்திசாலித்தனம் வேண்டாம், விஞ்ஞான ஆராய்ச்சியில் நாட்டு முதிய ஜாங்கை விட நேர்மையாக இருக்க வேண்டும், புத்திசாலித்தனமாக இருக்க வேண்டுமென்றால் கட்டுரை உங்களை முட்டாளாக்கும்.

தொகுப்பின் தயாரிப்பு எண்ணை நினைவில் கொள்ள வேண்டும்நீங்கள் கிட் ஆர்டர் செய்து கட்டுரை எழுதும் போது .கிட்டில் பொதுவாக இரண்டு எண்கள் உள்ளன: பூனை-பட்டியல் எண் (தயாரிப்பு எண், கட்டுரை எண்), லாட்-தயாரிப்பு லாட் எண் (தயாரிப்பு எந்தத் தொகுதியிலிருந்து வந்தது என்பதைக் குறிக்கப் பயன்படுகிறது).

கூடுதலாக, உயிர்வேதியியல் எதிர்வினைகளை ஆர்டர் செய்யும் போது CAS எண் அடிக்கடி பயன்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் நான் அதை ஒன்றாக பிரபலப்படுத்துவேன்.CAS எண் என்பது ஒவ்வொரு புதிய இரசாயன மருந்துக்கும் அமெரிக்க கெமிக்கல் சொசைட்டி வழங்கிய எண்ணாகும்.பொதுவாக, மூன்று எண்கள் ஒரு கோடு மூலம் இணைக்கப்படும்.ருஷூயின் CAS எண்: 7732-18-5.இரசாயனங்கள் பெரும்பாலும் பல மாற்றுப்பெயர்களைக் கொண்டுள்ளன, ஆனால் CAS எண் தனித்துவமானது.மருந்தை ஆர்டர் செய்யும் போது, ​​அதன் CAS எண்ணை முதலில் சரிபார்க்கலாம்.

வீட்டிற்கு அருகில், நாம் ஏன் இந்த விஷயங்களை தெளிவாக விவரிக்க வேண்டும்?உண்மையில், இது ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தலின் தரத்தை சரிபார்க்கவும் ஆகும்.கருவிகள் மற்றும் கருவிகளின் பயன்பாடு ஆர்.என்.ஏ பிரித்தலை மேலும் சீரானதாக மாற்றும்.சாதாரண ஆய்வகங்களின் பிரித்தெடுத்தல் அளவு பெரியதாக இல்லை, மேலும் அதை கிட் மூலம் பெறலாம்.

DNase அல்லது RNase சிகிச்சையின் விவரங்கள்
ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR இன் முக்கியமான பிரச்சினை DNA மாசுபடுவதைத் தடுப்பதாகும், மேலும் மாசு இருந்தால் பரிசோதனை செய்ய வேண்டாம்.எனவே, சோதனைச் செயல்பாட்டில் உள்ள டிஎன்ஏ முழுமையாகவும் முழுமையாகவும் அகற்றப்பட்டது என்பதை நிரூபிக்க, டிஎன்ஏவைச் செயலாக்க நீங்கள் பயன்படுத்திய செயல்முறையைக் குறிப்பிடுவது கட்டாயமாகும்.திட்ட வரைபடத்தால் குறிப்பிடப்படுகிறது.

ஆர்என்ஏ மற்றும் டிஎன்ஏவின் திட்ட வரைபடம்
பொதுவாக, டிஎன்ஏவை அகற்றும் முறை, பிரித்தெடுத்த பிறகு ஆர்என்ஏவை டிநேஸுடன் சிகிச்சை செய்வதாகும்.இருப்பினும், இவை ஒப்பீட்டளவில் பழைய முறைகள்.வணிகரீதியான RNA பிரித்தெடுக்கும் கருவிகள் DNase ஐ சேர்க்காமல் பிரித்தெடுக்கும் செயல்பாட்டின் போது DNAவை அகற்ற முடியும்.எடுத்துக்காட்டாக, Foregene வழங்கும் தொடர் கருவிகள்.

குறிப்பு: ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுக்கும் போது டிஎன்ஏவை அகற்றுவது மிகவும் ஆபத்தான இரட்டை முனைகள் கொண்ட வாள் ஆகும், இது ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தலின் செயல்பாட்டு நேரத்தை நீட்டித்து ஆர்என்ஏ சிதைவின் அபாயத்தை அதிகரிக்கும்.அடிப்படையில், இது ஆர்.என்.ஏ விளைச்சலுக்கும் தூய்மைக்கும் இடையிலான பரிமாற்றமாகும்.

கூடுதலாக, சிலிக்கா அடிப்படையிலான உறிஞ்சுதல் நெடுவரிசையில் சேர்க்கப்படும் DNase இன் அளவு மிகச் சிறியது, மேலும் விளைவை அடைய உயர்தர DNase பயன்படுத்தப்பட வேண்டும்.மேம்படுத்தப்படாத DNase ஐ விரைவாகவும் முழுமையாகவும் ஜீரணிக்க முடியாது.இது வணிகரின் தொழில்நுட்ப நிலைக்கான சோதனை.நிச்சயமாக, DNase இல்லாமல் டிஎன்ஏவை அகற்ற முடியும் என்று பெருமை பேசும் இன்னும் வித்தியாசமான வணிகர்கள் உள்ளனர்.டிநேஸ் இல்லாமல் டிஎன்ஏவை முற்றிலுமாக அகற்றிவிடலாம் என்று தம்பட்டம் அடித்துக் கொள்ளும் எவரையும் போக்கிரி என்று சொல்லலாம்.டிஎன்ஏ என்பது ஒப்பீட்டளவில் நிலையான இரட்டை இழைகள் கொண்ட அமைப்பாகும், மேலும் அதை பேசுவதன் மூலமும் சிரிப்பதன் மூலமும் அழிக்க முடியாது.

மாசு மதிப்பீடு
மதிப்பீட்டு முறை: எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் கண்டறிதல், 1% அகரோஸ், 6V/cm, 15min, ஏற்றுதல் 1-3 ul

நியூக்ளிக் அமில அளவு பகுப்பாய்வு
பொதுவாக UV ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்படுகிறது.OD260, OD280 மற்றும் OD230 ஆகிய மூன்று மதிப்புகளின் அர்த்தத்தை முதலில் பிரபலப்படுத்துகிறேன்.
·OD260nm: இது நியூக்ளிக் அமிலத்தின் அதிகபட்ச உறிஞ்சுதல் உச்சத்தின் உறிஞ்சுதல் அலைநீளமாகும், மேலும் சிறந்த அளவிடப்பட்ட மதிப்பு 0.1 முதல் 1.0 வரை இருக்கும்.இல்லையெனில், வரம்பிற்குள் கொண்டு வர மாதிரியை நீர்த்துப்போகச் செய்யவும் அல்லது குவிக்கவும்.
·OD280nm: இது புரதம் மற்றும் பினாலிக் பொருட்களின் மிக உயர்ந்த உறிஞ்சுதல் உச்சத்தின் உறிஞ்சுதல் அலைநீளமாகும்.
·OD230nm: இது கார்போஹைட்ரேட்டுகளின் அதிகபட்ச உறிஞ்சுதல் உச்சத்தின் உறிஞ்சுதல் அலைநீளமாகும்.

அடுத்து, ஒவ்வொரு குறிகாட்டியின் பங்கையும் பற்றி பேசலாம்.A260க்கு, இது நியூக்ளிக் அமிலத்தின் விளைச்சலை அளவிட பயன்படுகிறது.போது OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

தூய்மைக்காக, நாம் பொதுவாகக் காணும் விகிதங்களைப் பார்க்க வேண்டும்: OD260/280 மற்றும் OD260/230.
தூய டிஎன்ஏ: OD260/280 தோராயமாக 1.8க்கு சமம்.1.9க்கு அதிகமாக இருந்தால், ஆர்.என்.ஏ மாசு இருப்பதாகவும், 1.6க்கு குறைவாக இருந்தால், புரோட்டீன் மற்றும் பீனால் மாசு இருப்பதைக் குறிக்கிறது.
தூய RNA: 1.7
·OD260/230: அது டிஎன்ஏ அல்லது ஆர்என்ஏவாக இருந்தாலும், குறிப்பு மதிப்பு 2.5 ஆகும்.இது 2.0 க்கும் குறைவாக இருந்தால், சர்க்கரை, உப்பு மற்றும் கரிமப் பொருட்கள் மாசுபடுவதைக் குறிக்கிறது.

ஆர்என்ஏ ஒருமைப்பாடு

ஆர்என்ஏவின் ஒருமைப்பாட்டை அளவிடுவது மிகவும் முக்கியம்.பொதுவாக, 28S மற்றும் 18S ஆர்என்ஏ இடையே உள்ள பிரகாசம் இரு மடங்கு உறவா என்பதைச் சரிபார்க்க ஒரு ஆர்என்ஏ டினாட்டரேஷன் ஜெல் பரிசோதனை செய்வது அவசியம்.மூன்றாவது இசைக்குழு 5S தோன்றும்போது, ​​முதுகெலும்பில்லாதவை தவிர, ஆர்என்ஏ சிதையத் தொடங்கியது என்று அர்த்தம்.

ஆர்.என்.ஏ தர மதிப்பீட்டிற்கான தரவு: மேற்கூறிய சோதனைகளுக்கு மேலதிகமாக, ஆர்.என்.ஏ ஒருமைப்பாட்டின் அடிப்படையில் இன்னும் சில மேம்பட்ட கருவி சோதனைகளும் உள்ளன, எக்ஸ்பெரியன் ஆட்டோமேட்டிக் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் அமைப்பின் RQI ஒருமைப்பாடு சோதனை போன்றவை, ஆர்.என்.ஏ கண்ணுக்குத் தெரியாமல் சிதைகிறதா என்பதைக் கண்டறிய முடியும்.

அறிவியல் ஆராய்ச்சியில், ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR என்பது இலக்கு மரபணு மற்றும் உள் குறிப்பு மரபணு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான ஒப்பீடு ஆகும்.எனவே, ஆர்என்ஏ மாதிரி பாதுகாப்பு, ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல் போன்றவற்றின் செயல்பாட்டில், ஆர்என்ஏவின் ஒருமைப்பாட்டை உறுதி செய்வதே முதன்மையான குறிக்கோள்.

ஆர்என்ஏவின் ஒருமைப்பாடு இலக்கு மரபணுவிற்கும் உள் குறிப்பு மரபணுவிற்கும் இடையிலான சமநிலையை எவ்வாறு பாதிக்கிறது என்பதை கீழே உள்ள படத்தில் இருந்து எளிதாக புரிந்து கொள்ளலாம்.சீரழிவு மரபணு முழுமையின்மைக்கு வழிவகுக்கும், அது உள் குறிப்பு மரபணுவின் முழுமையின்மை அல்லது இலக்கு மரபணுவின் முழுமையின்மை, அது தரவுகளில் பெரும் தாக்கத்தை ஏற்படுத்தும்.

இலக்கு மரபணு மற்றும் குறிப்பு மரபணுவின் திட்ட வரைபடம் உண்மையாக இருக்கக்கூடாது

தடுப்பு சோதனை (அதிக அல்லது குறைந்த செறிவு அல்லது பிற நிலைமைகளின் கீழ் CT மதிப்பு ஒடுக்கப்பட்டதா)

இந்த உருவத்தை உதாரணமாக எடுத்துக் கொண்டால், ஐந்து வளைவுகளின் Ct மதிப்புகள் பின்வருமாறு.வளைவுகளுக்கு இடையில் CT மதிப்புகளின் விநியோகம் சீரற்றதாக உள்ளது, மேலும் Ct மதிப்புகள் அதிக மற்றும் குறைந்த செறிவுகளின் கீழ் தாமதமாகிறது, இது PCR தடுப்பின் வழக்கு.

முக்கிய புள்ளி: ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுக்கும் செயல்பாட்டில், நாம் தவறான கருத்துக்களைக் கைவிட்டு சரியானவற்றை நிறுவ வேண்டும்.

தவறான கருத்து: ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுத்தல் விளைச்சலைத் தொடர்கிறது, ஆர்.என்.ஏ.வின் அளவு எவ்வளவு அதிகமாகப் பெறப்படுகிறதோ, அவ்வளவு சிறந்தது.உண்மையில், நாம் அளவீடு செய்யும் போது, ​​மரபணுக்களின் எண்ணிக்கை மிக அதிகமாக இல்லை என்றால், நமக்கு அதிக ஆர்என்ஏ தேவையில்லை.நீங்கள் பிரித்தெடுக்கும் ஆர்என்ஏ அளவு போதுமானதை விட அதிகமாக உள்ளது.

சரியான கருத்து:ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல் தூய்மை, ஒருமைப்பாடு மற்றும் நிலைத்தன்மை ஆகியவற்றைப் பின்பற்ற வேண்டும்.தூய்மையானது, அடுத்தடுத்த தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் தடுக்கப்படாமல் இருப்பதையும், டிஎன்ஏவால் தரவு பாதிக்கப்படாமல் இருப்பதையும் உறுதிசெய்யும்.ஒருமைப்பாடு இலக்கு வரிசைகள் மற்றும் உள் குறிப்புகளின் சமநிலையை உறுதி செய்கிறது.நிலைத்தன்மையானது நிலையான மாதிரி ஏற்றுதலை உறுதி செய்கிறது.

MIQE (4) - தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன்
தவறான கருத்து: அதிக மாதிரி அளவைப் பின்தொடர்தல்.
சரியான கருத்துஆர்என்ஏ ஏற்றப்பட்ட அளவைப் பொருட்படுத்தாமல் நிலைத்தன்மையை (நிலைத்தன்மையை) தொடரவும், சிடிஎன்ஏவில் உள்ள வேறுபாடுகள் எம்ஆர்என்ஏவில் உள்ள வேறுபாடுகளை உண்மையாகவே பிரதிபலிக்கும் என்பதை உறுதிசெய்யும் வகையில், ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் செயல்திறன் சீராக இருக்கும்.
இந்த செயல்முறையை ஒரு திட்ட வரைபடத்துடன் விளக்குகிறோம்:

தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்திறனின் திட்ட வரைபடம், உண்மையாக இருக்கக்கூடாது
முதலில், ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்முறைக்கும் பிசிஆர் செயல்முறைக்கும் உள்ள வித்தியாசத்தை நாம் புரிந்து கொள்ள வேண்டும்.PCR பல வெப்பமூட்டும் மற்றும் அனீலிங் செயல்முறைகளுக்கு உட்படுகிறது, மேலும் இலக்கு துண்டு அதிவேகமாக வளர்கிறது;ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனில் இந்த செயல்முறை இல்லை என்றாலும், ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் உண்மையில் ரிப்ளிகேஷன் செயல்பாட்டின் போது, ​​ஆர்என்ஏவின் பல துண்டுகள் என நாம் கற்பனை செய்யலாம்.

சிடிஎன்ஏ தகவல்களைப் பெற முடியும் என்பதால், அதை இப்போது புரிந்து கொள்ள வேண்டும், ஏனென்றால் பெரிய மற்றும் சிறிய துண்டுகள் தலைகீழாகப் படியெடுக்கப்பட்டுள்ளன, மேலும் ஒரு துண்டில் கவனம் செலுத்துவது சாத்தியமில்லை.ஆர்என்ஏவின் அளவு ஒப்பீட்டளவில் சிறியதாக இருப்பதால், பெறப்பட்ட சிடிஎன்ஏ அளவும் ஒப்பீட்டளவில் சிறியது, பிசிஆர் போலல்லாமல், இது ஒரு பெருக்க விளைவைக் கொண்டுள்ளது, எனவே அதைக் கண்டறிவது அடிப்படையில் சாத்தியமற்றது.

cDNA எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் முடிவுகள்
இரண்டாவதாக, வெறுமனே, தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ஒன்றுக்கு ஒன்று செய்யப்படுகிறது, ஆனால் எந்த நிறுவனத்திடமிருந்தும் எந்த தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸும் இந்த விளைவை அடைய முடியாது.அடிப்படையில், பெரும்பாலான தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ்களின் செயல்திறன் 30-50% வரை அலைகிறது.அப்படியானால், ஒப்பீட்டளவில் நிலையான தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்திறனைப் பெறுவோம், இதைத்தான் படத்தில் பார்க்க விரும்புகிறோம்: 3 ஆர்என்ஏக்கள் 2 சிடிஎன்ஏக்களைப் பெறுகின்றன, 6 ஆர்என்ஏக்கள் 4 சிடிஎன்ஏக்களைப் பெறுகின்றன, எனவே எவ்வளவு மாதிரி ஏற்றப்பட்டாலும், தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்திறன் ஒப்பீட்டளவில் நிலையானதாக இருக்கும்.தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்திறன் நிலையற்றது மற்றும் அதிக செறிவு தடுக்கப்படும் சூழ்நிலையை நாங்கள் பார்க்க விரும்பவில்லை.

எனவே, தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்திறன் நிலையானதா என்பதை எவ்வாறு சரிபார்க்கலாம்?முறை மிகவும் எளிமையானது, நீங்கள் ஒரு ஒப்பீட்டுச் சோதனையை மட்டும் செய்ய வேண்டும்: ஒன்று ஆர்என்ஏவை இரட்டிப்பாக்கிய பிறகு சிடிஎன்ஏவில் மாற்றுவது, மற்றொன்று சிடிஎன்ஏவில் தலைகீழாக டிரான்ஸ்கிரிப்ட் செய்த பிறகு இரட்டிப்பு நீர்த்துப்போகச் செய்வது, பின்னர் பெறப்பட்ட சாய்வு சீரானதா என்பதைப் பார்க்க qPCR செய்யுங்கள்.ஒரு சிறந்த மாணவராக, நீங்கள் அதை நொடிகளில் புரிந்து கொள்ள வேண்டும்.கீழே காட்டப்பட்டுள்ளது போல்:

ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் செயல்திறன் நிலையானதா என்பதை சோதிக்க ஆர்என்ஏ மற்றும் சிடிஎன்ஏவை நீர்த்துப்போகச் செய்தல்
தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் மற்றும் கிட்
எப்படி சரியான ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR சிறந்த ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் மற்றும் கிட் ஆகியவற்றைக் கொண்டிருக்கும்.ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் மூலத்தின்படி தோராயமாக இரண்டு வகைகளாகப் பிரிக்கப்பட்டுள்ளது, AMV அல்லதுஎம்-எம்.எல்.வி, மற்றும் அவற்றின் செயல்திறன் அட்டவணையில் காட்டப்பட்டுள்ளதைப் போன்றது.

RNase H செயல்பாடு
RNase H என்பது Ribonuclease H, சீனப் பெயர் ribonuclease H, இது என்டோரிபோநியூக்லீஸ் ஆகும், இது DNA-RNA கலப்பினச் சங்கிலியில் RNAவை குறிப்பாக ஹைட்ரோலைஸ் செய்யக்கூடியது.RNase H ஆனது ஒற்றை இழை அல்லது இரட்டை இழை DNA அல்லது RNA இல் உள்ள பாஸ்போடைஸ்டர் பிணைப்புகளை ஹைட்ரோலைஸ் செய்ய முடியாது.சிடிஎன்ஏவின் இரண்டாவது இழையின் தொகுப்பில் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.

இது ஒரு விசித்திரமான விஷயம்.தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸில் RNase H செயல்பாடு உள்ளது என்று நாங்கள் கூறுகிறோம், தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸில் RNase H உள்ளது, மேலும் RNase H ஐ தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸிலிருந்து பிரிக்க முடியாமல் போகலாம், சில குழுக்கள் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸில் உள்ள இணக்கத்தின் காரணமாக இந்த செயல்பாடு தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸால் ஏற்படுகிறது.

எனவே, AMV இன் உயர் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்திறன் எதுவாக இருந்தாலும், அதன் RNase H செயல்பாடு cDNA விளைச்சலைக் குறைக்கிறது.நிச்சயமாக, சிடிஎன்ஏவின் விளைச்சலை அதிகரிக்க முடிந்தவரை ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸில் RNase H செயல்பாட்டை அகற்ற வினைப்பொருள் உற்பத்தியாளர்கள் தொடர்ந்து தங்கள் தயாரிப்புகளை மேம்படுத்துகின்றனர்.
அனீலிங் வெப்பநிலை

வெவ்வேறு வெப்பநிலைகளில் RNA இன் இரண்டாம் நிலை அமைப்பு
வெவ்வேறு வெப்பநிலைகளில் ஆர்என்ஏவின் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பிற்கு மேலே உள்ள படத்தைப் பார்க்கவும், மேலும் குறிப்பிட்ட வெப்பநிலை மற்றும் உப்பு செறிவு நிலைகளின் கீழ் இலக்கு துண்டின் இரண்டாம் கட்டமைப்பைத் தீர்மானிக்க mFold ஆன்லைன் கருவியைப் பயன்படுத்தவும்.55°C இல், ஆர்என்ஏவின் இரண்டாம் நிலை அமைப்பு மிகவும் சிக்கலானது, ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் வேலை செய்ய முடியாது, மேலும் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பை 65 டிகிரி செல்சியஸ் வரை முழுமையாகத் தீர்க்க முடியாது, அதே நேரத்தில் AMV மற்றும் M-MLV இன் உகந்த வெப்பநிலை இந்த வெப்பநிலையை விட மிகக் குறைவாக உள்ளது.
என்ன செய்ய?இரண்டாம் நிலை அமைப்பு என்பது வார்ப்புருவின் நிரப்பு இணைதல் ஆகும், இது ப்ரைமர் மற்றும் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் மற்றும் டெம்ப்ளேட் ஆகியவற்றுக்கு இடையே வலுவான போட்டிக்கு வழிவகுக்கிறது, இதன் விளைவாக குறைந்த E மற்றும் மோசமான ரிபீட்டிபிலிட்டி போன்ற தொடர்ச்சியான சிக்கல்கள் ஏற்படுகின்றன.

என்ன செய்ய?அனீலிங் வெப்பநிலையை முடிந்தவரை மட்டுமே அதிகரிக்கவும்.

பல மறுஉற்பத்தி உற்பத்தியாளர்கள் மரபணு பொறியியல் மூலம் தங்கள் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸை மேம்படுத்துகின்றனர்.சிலர் ஜிஃபான் மற்றும் ஐடெலாய் போன்ற எதிர்வினை வெப்பநிலையை அதிகரிக்கின்றனர், மேலும் சிலர் என்சைம் மற்றும் ஆர்என்ஏ டெம்ப்ளேட்டிற்கு இடையே உள்ள தொடர்பை மேம்படுத்துவதற்காக ஆர்நேஸ் எச் என்சைமின் செயலில் உள்ள குழுவை நீக்குகின்றனர்.அதிக ஈடுபாடு போட்டித்தன்மையுடன் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பை கசக்கி, சீராக படிக்க முடியும், மேலும் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் செயல்திறனையும் பெரிதும் மேம்படுத்துகிறது.
முக்கிய புள்ளி: தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மிகவும் முக்கியமானது, தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்திறனின் நிலைத்தன்மையைத் தொடர (என்சைம்கள் திறமையாக மட்டுமல்ல, நிலையானதாகவும் இருக்க வேண்டும்), மாறாக ஏற்றப்பட்ட மாதிரியின் அளவைக் காட்டிலும், இது ஒரு பெரிய அளவிலான ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR ஆக இல்லாவிட்டால், அது சாத்தியமே இல்லை.பல சிடிஎன்ஏக்கள்.
பல்வேறு உற்பத்தியாளர்களும் நிலைத்தன்மையைப் பின்தொடர்வதில் சில முயற்சிகளை மேற்கொண்டுள்ளனர்.எடுத்துக்காட்டாக, பெரும்பாலான நிறுவனங்கள் இப்போது ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனை விற்பனைக்கு ஒரு நிலையான கிட் என தொகுத்துள்ளன, இது ஒரு நல்ல தேர்வாகும்.
எடுத்துக்காட்டாக, Foregene இன் RT ஈஸி தொடர் கருவிகள்:

ஆர்டி ஈஸி ஐ (முதல் ஸ்ட்ராண்ட் சிடிஎன்ஏ தொகுப்புக்கான முதன்மை பிரிமிக்ஸ்)

MIQE (5) - இலக்கு மரபணு தகவல்

மேலே உள்ள படம் விளக்குகிறது
1. இந்த மரபணு மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்படும் சோதனைகளுக்கு பயனுள்ளதாக உள்ளதா என்பதை பொதுவாக மீண்டும் மீண்டும் சோதனைகள் மூலம் சரிபார்க்க முடியும்.
2. ஜீன் ஐடி, உங்களுக்குத் தெரியும்.
3. மரபணு நீளம், இலக்கு மரபணுவின் மொத்த நீளம் நிச்சயமாக எந்த பிரச்சனையும் இல்லை.ப்ரைமர்களை வடிவமைக்கும் போது, ​​சிறந்த பெருக்க செயல்திறனை உறுதிசெய்ய, ஆம்ப்ளிகானின் நீளம் 80-200bp க்கு இடையில் இருப்பதை உறுதிசெய்யவும்.
4. சீக்வென்ஸ் ப்ளாஸ்ட் ஒப்பீட்டுத் தகவல், குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்தைத் தடுக்க இலக்கு மரபணுவை மரபணு வங்கியில் ஒப்பிட வேண்டும்.
5. சூடோஜீன்களின் இருப்பு.ஒரு சூடோஜீன் என்பது ஒரு சாதாரண மரபணுவைப் போன்ற டிஎன்ஏ வரிசையாகும், ஆனால் அதன் இயல்பான செயல்பாட்டை இழக்கிறது.இது பெரும்பாலும் யூகாரியோட்டுகளின் பல மரபணு குடும்பத்தில் உள்ளது.இது பொதுவாக ψ ஆல் குறிக்கப்படுகிறது.இது மரபணுவில் செயல்படாத மரபணு DNA நகலாகும், இது குறியீட்டு மரபணு வரிசைக்கு மிகவும் ஒத்திருக்கிறது., பொதுவாக படியெடுத்தல் இல்லை, மேலும் தெளிவான உடலியல் பொருள் இல்லை.
6. எக்ஸான்கள் மற்றும் இன்ட்ரான்களுடன் தொடர்புடைய ப்ரைமர்களின் நிலை.ஆரம்ப ஆண்டுகளில், டிஎன்ஏ மாசுபாட்டின் சிக்கலை நாங்கள் தீர்க்கும்போது, ​​ப்ரைமர்கள், எக்ஸான்கள் மற்றும் இன்ட்ரான்களின் நிலைகளுக்கு நாங்கள் அடிக்கடி கவனம் செலுத்தினோம், பொதுவாக டிஎன்ஏ பெருக்கத்தைத் தவிர்ப்பதற்காக இன்ட்ரான்கள் முழுவதும் ப்ரைமர்களை வடிவமைப்பதாகக் கருதினோம்.கீழே உள்ள படத்தைப் பார்க்கவும்: கருப்பு என்பது இன்ட்ரான்களைக் குறிக்கிறது, பல்வேறு ப்ளூக்கள் எக்ஸான்களைக் குறிக்கின்றன, இளஞ்சிவப்பு பொதுவான ப்ரைமர்களைக் குறிக்கிறது, மற்றும் பிரகாசமான சிவப்பு என்பது இன்ட்ரான்-ஸ்பானிங் ப்ரைமர்களைக் குறிக்கிறது.

திட்டவட்டமான, ஒருபோதும் உண்மை இல்லை
இது என்ன சரியான திட்டமாகத் தெரிகிறது, ஆனால் உண்மையில், பெரும்பாலான சந்தர்ப்பங்களில், டிரான்ஸ்-இன்ட்ரான் ப்ரைமர்கள் கற்பனை செய்வது போல் மாயாஜாலமாக இல்லை, மேலும் அவை குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்தையும் ஏற்படுத்தும்.எனவே டிஎன்ஏ மாசுபடுவதைத் தடுப்பதற்கான சிறந்த வழி டிஎன்ஏவை முழுவதுமாக அகற்றுவதுதான்.
7. இணக்க கணிப்பு.இந்த எடுத்துக்காட்டை மீண்டும் பயன்படுத்தி, ஒரு குறிப்பிட்ட வெப்பநிலை மற்றும் உப்பு செறிவில் இலக்கு துண்டின் இரண்டாம் கட்டமைப்பை தீர்மானிக்க mFold ஆன்லைன் கருவியைப் பயன்படுத்தவும்.

வெவ்வேறு வெப்பநிலைகளில் RNA இன் இரண்டாம் நிலை அமைப்பு
இரண்டாம் நிலை அமைப்பானது, வார்ப்புருவின் இணை இணைத்தல் ஆகும், இது ப்ரைமர் மற்றும் டெம்ப்ளேட் இணைத்தல் ஆகியவற்றுக்கு இடையே வலுவான போட்டிக்கு வழிவகுக்கும், மேலும் ப்ரைமர் பைண்டிங்கின் வாய்ப்புகள் குறைவாக இருக்கும், இதன் விளைவாக குறைந்த E மற்றும் மோசமான மறுநிகழ்வு போன்ற தொடர்ச்சியான சிக்கல்கள் ஏற்படுகின்றன.மென்பொருள் முன்கணிப்பு மூலம், இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பு சிக்கல் இல்லை என்றால், அது நன்றாக இருக்கும்.இருந்தால், இந்த சிக்கலை எவ்வாறு தீர்ப்பது என்பதை எங்கள் பின்தொடர்தல் கட்டுரை குறிப்பாக விவாதிக்கும்.

MIQE (6)-qPCR ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகள்

ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR க்கு, ஒவ்வொரு நாளும் நீங்கள் போராடும் முதல் விஷயம் RNA பிரித்தெடுத்தல் ஆகும், இரண்டாவது விஷயம் முதன்மை வடிவமைப்பாக இருக்கலாம்.
முதலில், MIQE சரிபார்ப்புப் பட்டியலின்படி ப்ரைமர் வடிவமைப்பு பற்றிய விதிகளை நாங்கள் இன்னும் சரிபார்க்கிறோம்.இது மிகவும் எளிமையானது, அசிங்கமானவர்கள் சிரிக்க முடியும், அதை ஒரே வாக்கியத்தில் முடிக்கலாம்: ப்ரைமர் ஆய்வின் வரிசை மற்றும் நிலை மற்றும் மாற்றும் முறையைக் கண்டறியவும்.ப்ரைமர் சுத்திகரிப்பு முறைக்கு, ப்ரைமர் தொகுப்பு தற்போது மிகவும் மலிவானது, qPCR PAGE மற்றும் அதற்கு மேற்பட்ட சுத்திகரிப்பு முறைகளுக்கு தகுதியானது, மேலும் தொகுப்பு கருவியின் தகவல் முக்கியமல்ல.பலர் பல தசாப்தங்களாக ப்ரைமர்களைச் செய்து வருகின்றனர், மேலும் சின்தசைசர் ABI3900 என்பது தெரியாது.
ப்ரைமர் வடிவமைப்பின் கொள்கைகளைப் பொறுத்தவரை, அவற்றை நீங்கள் நினைவில் வைத்துக் கொள்ள வேண்டிய அவசியமில்லை, ஏனென்றால் பெரும்பாலான ப்ரைமர் வடிவமைப்பு மென்பொருள் அல்லது ஆன்லைன் கருவிகள் இந்தப் பிரச்சனைகளை (பரிந்துரைக்கப்படும் ஆன்லைன் கருவி Primer3.ut.ee/) கவனித்துக் கொள்ளலாம், மேலும் 99.999% ப்ரைமர் வடிவமைப்பை கைமுறையாகச் செய்யவில்லை பாருங்கள், ஆசிரியர் சில நேரங்களில் நூற்றுக்கணக்கான ப்ரைமர்களை வடிவமைக்கிறார்.
ப்ரைமர்கள் வடிவமைக்கப்பட்ட பிறகு பின்வரும் புள்ளிகளைச் சரிபார்க்கவும்:
1. டிசைன் ப்ரைமர்கள் 3′ இறுதிக்கு அருகில்: சிடிஎன்ஏ ஃபர்ஸ்ட்-ஸ்ட்ராண்ட் தொகுப்புக்கு ஒலிகோ டிடி ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தினால், ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் திறன் மற்றும் ஆர்என்ஏ ஒருமைப்பாடு ஆகியவற்றைக் கருத்தில் கொண்டு, டிசைன் ப்ரைமர்கள் பெருக்க செயல்திறனை மேம்படுத்த 3′ முனைக்கு அருகில் வடிவமைக்கப்பட வேண்டும்.பின்வருமாறு விளக்க ஒரு படத்தைப் பயன்படுத்தவும் (இதைப் புரிந்து கொள்ள வழி இல்லை):

ப்ரைமர்கள் ஏன் 3′ முனைக்கு அருகில் வடிவமைக்கப்பட வேண்டும், அது உண்மையாக இருக்கக்கூடாது
2. TM மதிப்பு: Tm மதிப்பு 55-65°C இல் உள்ளது (ஏனென்றால் எக்ஸோநியூக்லீஸ் செயல்பாடு அதிகபட்சமாக 60°C இல் உள்ளது), மற்றும் GC உள்ளடக்கம் 40%-60% ஆக உள்ளது.
3. வெடிப்பு: மரபணுவின் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்தைத் தவிர்ப்பதற்காக, துணைச் சரிபார்ப்புக்கு பிளாஸ்ட் பயன்படுத்தப்பட வேண்டும்.

MIQE(7)-qPCR செயல்முறை

1. qPCR கிட்
MIQE இன் தேவைகளின்படி, PCR எதிர்வினை அமைப்பின் உள்ளமைவு, என்ன கிட் பயன்படுத்தப்படுகிறது, உற்பத்தியாளர் யார், எதிர்வினை அமைப்பு எவ்வளவு பெரியது, சாய முறை அல்லது ஆய்வு முறை பயன்படுத்தப்பட்டதா, PCR நிரல் அமைப்புகள் உள்ளிட்ட முழுமையான எதிர்வினை நிலைமைகளை கட்டுரையில் தெளிவாக விவரிக்க வேண்டும்.கிட் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வரை, மேலே உள்ள தகவல்கள் அடிப்படையில் தீர்மானிக்கப்படுகின்றன என்பதை மூத்த ஓட்டுநர்கள் நிச்சயமாகக் கண்டுபிடிப்பார்கள்.
தற்போது, ​​ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR கருவிகளின் உற்பத்தி மற்றும் உற்பத்தி மிகவும் முதிர்ந்த தொழில்நுட்பமாகும்.நீங்கள் மிகவும் மோசமான உற்பத்தியாளர்களைத் தேர்ந்தெடுக்காத வரை, சிக்கல்களின் நிகழ்தகவு அதிகமாக இருக்காது, ஆனால் நாங்கள் இன்னும் சில புள்ளிகளை உங்களுடன் பகிர்ந்து கொள்ள விரும்புகிறோம்:
ஹாட்-ஸ்டார்ட் டாக் என்சைம்:PCR இன் மிக முக்கியமான பகுதி சூடான-தொடக்க Taq என்சைம் ஆகும்.சந்தையில் உள்ள ஹாட்-ஸ்டார்ட் என்சைம்கள் பொதுவாக இரண்டு வகைகளாகப் பிரிக்கப்படுகின்றன, ஒன்று வேதியியல் ரீதியாக மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஹாட்-ஸ்டார்ட் என்சைம் (நீங்கள் இதை பாரஃபின் உட்பொதித்தல் என்று கற்பனை செய்யலாம்), மற்றொன்று ஆன்டிபாடி மாற்றத்திற்கான ஹாட்-ஸ்டார்ட் என்சைம் (ஆன்டிஜென்-ஆன்டிபாடி பிணைப்பு).வேதியியல் மாற்றம் என்பது சூடான-தொடக்க நொதிகளின் ஆரம்ப வழி.ஒரு குறிப்பிட்ட வெப்பநிலையை அடைந்தவுடன், நொதி அதன் செயல்பாட்டை வெளியிடும்.ஆன்டிபாடி-மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஹாட்-ஸ்டார்ட் என்சைம், நொதியின் செயல்பாட்டைத் தடுக்க உயிரியல் முறைகளைப் பயன்படுத்துகிறது.ஒரு குறிப்பிட்ட வெப்பநிலையை அடையும் போது, ​​ஆன்டிபாடி ஒரு புரதமாக சிதைக்கப்பட்டு செயலிழக்கப்படும், மேலும் நொதி செயல்பாடு செயல்பாட்டுக்கு கொண்டு வரப்படும்.

இருப்பினும், இதனால் என்ன பயன்?இதுவே, ஆன்டிபாடி-மாற்றியமைக்கப்பட்ட என்சைம்களின் வெளியீட்டுச் செயல்பாடு வேதியியல் மாற்றியமைக்கப்பட்ட நொதிகளை விட வேகமானது, எனவே உணர்திறன் அடிப்படையில், ஆன்டிபாடி-மாற்றியமைக்கப்பட்ட என்சைம்கள் ஒரு சிறிய நன்மையைக் கொண்டுள்ளன, இதனால் சந்தையில் உள்ள கருவிகளில் வேதியியல் ரீதியாக மாற்றியமைக்கப்பட்ட நொதிகள் இல்லை.இருந்தால், இந்த உற்பத்தியாளரின் தொழில்நுட்பம் இன்னும் மில்லினியத்தின் சகாப்தத்தில் சிக்கியுள்ளது.
மெக்னீசியம் அயனி செறிவு:PCR எதிர்வினையில் மெக்னீசியம் அயனி செறிவு மிகவும் முக்கியமானது.தகுந்த மெக்னீசியம் அயனி செறிவு Taq என்சைம் செயல்பாடு வெளியீட்டை ஊக்குவிக்கும்.செறிவு மிகக் குறைவாக இருந்தால், என்சைம் செயல்பாடு கணிசமாகக் குறைக்கப்படும்;செறிவு மிக அதிகமாக இருந்தால், என்சைம்-வினையூக்கிய குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கம் மேம்படுத்தப்படும்.மெக்னீசியம் அயனிகளின் செறிவு ப்ரைமர்களின் அனீலிங், டெம்ப்ளேட்டின் உருகும் வெப்பநிலை மற்றும் PCR தயாரிப்புகளை பாதிக்கும், இதனால் பெருக்கப்பட்ட துண்டுகளின் விளைச்சலை பாதிக்கும்.மெக்னீசியம் அயனிகளின் செறிவு பொதுவாக 25mM இல் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது.நிச்சயமாக, ஒரு நல்ல கருவிக்கு, மெக்னீசியம் அயனிகளின் செறிவு நன்கு கட்டுப்படுத்தப்பட வேண்டும்.சில வணிகர்கள் மக்னீசியம் அயன் செலேட்டிங் முகவரை மறுஉருவாக்கத்தில் சேர்க்கிறார்கள், இது மெக்னீசியம் அயனி செறிவின் தானியங்கி சரிசெய்தலின் விளைவை அடைய முடியும்.
ஃப்ளோரசன்ட் சாய செறிவு:நாம் வழக்கமாகப் பயன்படுத்தும் SYBR பச்சை நிறமான ஃப்ளோரசன்ட் சாயம், இரட்டை இழை DNAவின் சிறிய பள்ளத்துடன் பிணைப்பதன் மூலம் முக்கியமாக ஒளிரும் தன்மையை உருவாக்குகிறது. பின்னணி சமிக்ஞை.
PS: அதன் ஒளி-உணர்திறன் பண்புகள் காரணமாக, சந்தையில் உள்ள பொருட்கள் பொதுவாக பழுப்பு ஒளிபுகா மையவிலக்கு குழாய்களில் (கீழே உள்ள படத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது) தொகுக்கப்படுகின்றன.இருப்பினும், இது ஒரு சிக்கலைச் சந்திக்கும்.மாதிரி எடுக்கும்போது திரவம் உறிஞ்சப்படுகிறதா என்பதைப் பார்ப்பது கடினம்.இந்த வகையில், Qingke உண்மையில் மிகவும் பயனர் நட்பு (கீழே உள்ள படத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது), மற்றும் வெளிப்படையான குழாய் ஒரு ஒளிபுகா டின் பையில் தொகுக்கப்பட்டுள்ளது.பின்னர் அதை ஒரு டின் பையில் வைக்கவும், வெளிச்சத்தைத் தவிர்ப்பது மற்றும் மாதிரி எடுப்பதற்கான வசதியை கணக்கில் எடுத்துக் கொள்ளுங்கள்.நீங்கள் சரியான தயாரிப்பு எண்ணைத் தேர்ந்தெடுக்க வேண்டும்.TSE204 ஒரு சூப்பர் செலவு குறைந்த இருப்பு, இது என்னை புல் நடவு செய்ய தூண்டுகிறது.

ஃப்ளோரசன்ட் சாயத்தின் செறிவு மிகவும் முக்கியமானது.செறிவு மிகவும் குறைவாக இருந்தால், பெருக்க வளைவு பிந்தைய கட்டத்தில் மேலே செல்லாது மற்றும் சரியானதாக இருக்காது;செறிவு மிக அதிகமாக இருந்தால், அது இரைச்சல் குறுக்கீட்டை ஏற்படுத்தும்.ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR முக்கியமாக CT மதிப்பைப் பொறுத்தது என்பதால், ஃப்ளோரசன்ட் சாயத்தின் செறிவு சரியாக சரிசெய்யப்படாவிட்டால், உயர் புள்ளியை விட குறைந்த புள்ளி சிறந்தது.நிச்சயமாக, பொருத்தமான சாய செறிவு சிறந்தது.

ROX: ROX சாயங்கள் நன்கு-கிணறு ஒளிரும் சிக்னல் பிழைகளை சரிசெய்யப் பயன்படுகின்றன.சில கருவி உற்பத்தியாளர்களுக்கு அளவுத்திருத்தம் தேவைப்படுகிறது, மற்றவர்களுக்கு இல்லை.எடுத்துக்காட்டாக, தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்கின் ரியல் டைம் பிசிஆர் பெருக்க கருவியின் பயன்பாட்டிற்கு வழக்கமாக அளவுத்திருத்தம் தேவைப்படுகிறது, இதில் 7300, 7500, 7500ஃபாஸ்ட், ஸ்டெப்ஒன்பிளஸ் போன்றவை அடங்கும். பொதுவான கிட் வழிமுறைகள் அதை விவரிக்கும்.
Foregene இன் qPCR கலவையில் ROX சாயம் உள்ளது, இது பல்வேறு மாடல்களில் பயன்படுத்த வசதியானது.

ரியல் டைம் பிசிஆர் கிட்-தக்மான்

பலவீனமான ஹைட்ரஜன் பிணைப்பு சிகிச்சை: பலவீனமான ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகளின் சிகிச்சை ஒப்பீட்டளவில் தொழில்நுட்ப விஷயமாகும்.பல கருவிகளின் கையேடுகளை எதுவும் படிக்கவில்லை, ஆனால் அவர்களில் யாரும் இந்த தலைப்பைக் குறிப்பிடவில்லை.உண்மையில், இது மிகவும் முக்கியமானது.தளங்களின் சேர்க்கை முக்கியமாக ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகளின் வலிமையைப் பொறுத்தது.வலுவான ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகள் சாதாரண பெருக்கம், மற்றும் பலவீனமான ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகள் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்திற்கு வழிவகுக்கும்.பலவீனமான ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகளை அகற்ற முடியாவிட்டால், குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்தைத் தவிர்க்க முடியாது.ஆசிரியரின் எல்லைக்குள், சில நிறுவனங்கள் மட்டுமே இந்த சிக்கலைக் கவனித்துள்ளன.நீங்கள் கிட் வாங்கும் போது, ​​நீங்கள் தேர்வு செய்ய விரும்பும் கருவிக்கு இது சம்பந்தமாக ஒரு தீர்வைக் கருத்தில் கொண்டீர்களா என்பதை நீங்கள் குறிப்பிடலாம்.

எதிர்வினை அளவு: 20-50ul அமைப்பு பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் சிறிய தொகுதிகள் பிழைகளை ஏற்படுத்தும்.பொதுவாக, கிட் வழிமுறைகள் PCR எதிர்வினை தொகுதிகளைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கும்.புத்திசாலித்தனமாக இருக்காதீர்கள் மற்றும் செலவுகளைச் சேமிக்க சிறிய தொகுதிகளைப் பயன்படுத்துங்கள்.இலக்கு.வணிகர்களால் பரிந்துரைக்கப்பட்ட அளவு உண்மையில் சோதிக்கப்பட்டது, மேலும் சிறிய தொகுதிகளால் ஏற்படும் பிழைகளின் சிக்கலை அவர்களால் தீர்க்க முடியாது.
2. டியூப் பிளேட்டின் உற்பத்தியாளர் மற்றும் கட்டுரை எண்
ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR இன் கொள்கை அனைவருக்கும் தெரியும்.ஃப்ளோரசன்ஸ் சேகரிப்பு முக்கியமாக PCR குழாய் தொப்பிகள் மூலம் மேற்கொள்ளப்படுகிறது.PCR நுகர்பொருட்களைத் தேர்ந்தெடுக்கும்போது, ​​இரண்டு புள்ளிகளுக்கு கவனம் செலுத்துங்கள்: நல்ல ஒளி பரிமாற்றம் மற்றும் கருவிக்கு ஏற்றது.பொதுவாக, முக்கிய பிராண்டுகளின் பலகைகள் மற்றும் குழாய்கள் நன்றாக இருக்கும், ஆனால் நீங்கள் தழுவல் அடிப்படையில் கவனமாக தேர்வு செய்ய வேண்டும், இல்லையெனில் நீங்கள் கருவியைப் பயன்படுத்த முடியாது.

4. உயர் நிலை அறிவு

MIQE (8)-qPCR சரிபார்ப்பு
இதுதான் qPCR இன் முதன்மையான முன்னுரிமை!எத்தனையோ மாவீரர்கள் இங்கே மணலில் விழுந்திருக்கிறார்கள்.நிச்சயமாக, நீங்கள் அதிர்ஷ்டசாலி மற்றும் நீங்கள் படித்த மரபணுக்கள் எளிமையானவை, எனவே நீங்கள் பனி குகை வழியாக காற்றுடன் மிதந்தீர்கள்.qPCR இன் சரிபார்ப்புத் தகவல், தரவின் நம்பகத்தன்மையை சோதிக்கும் நோக்கம் கொண்டது.தேவையான சரிபார்ப்புத் தகவலைப் பின்வருமாறு பட்டியலிடுகிறோம்:

1.குறிப்பு சோதனை
இலக்கு மரபணு பெருக்கத்தின் தனித்தன்மையானது எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் படம் ஒரு ஒற்றை இசைக்குழுவாக உள்ளதா என்பதைச் சரிபார்ப்பதன் மூலம் சோதிக்கப்படுகிறது;வரிசைப்படுத்துதல் சரிபார்ப்பு;உருகும் வளைவு உச்ச வரைபடம் ஒற்றை உள்ளதா என்று பார்க்க;நொதி செரிமான சரிபார்ப்பு மற்றும் பிற முறைகள்.
இங்கே, நாம் டி மீது கவனம் செலுத்துகிறோம்உருகும் வளைவு முறையைப் பயன்படுத்தி குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்தின் பகுப்பாய்வு.பொதுவாக, நாம் ப்ரைமர்களை வடிவமைக்கும்போது, ​​தயாரிப்பு துண்டின் அளவு 80-200bp வரம்பில் இருக்க வேண்டும், இது PCR தயாரிப்பின் உருகும் வெப்பநிலையை 80-85 °C வரம்பாக மாற்றுகிறது.எனவே, இதர சிகரங்கள் இருந்தால், வேறு குறிப்பிடப்படாத பெருக்க தயாரிப்புகள் இருக்க வேண்டும்;உச்சம் 80°Cக்குக் கீழே தோன்றினால், அது பொதுவாக ஒரு ப்ரைமர் டைமராகக் கருதப்படுகிறது;உச்சம் 85°Cக்கு மேல் தோன்றினால், அது பொதுவாக டிஎன்ஏ மாசுபாடு அல்லது பெரிய துண்டுகளின் குறிப்பிடப்படாத பெருக்கமாக கருதப்படுகிறது.
குறிப்பு: சில நேரங்களில் 80 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் ஒரு உச்சநிலை மட்டுமே இருக்கும்.இந்த நேரத்தில், இந்த கருத்தை கண்டிப்பாக கடைபிடிக்க வேண்டும்.பெருக்க முடிவுகள் அனைத்தும் ப்ரைமர் டைமர்களாக இருக்கலாம்.

சாதாரண உருகும் வளைவு (குறிப்பிடாத பெருக்கம் இல்லாத ஒற்றை உச்சம்)

சிக்கலான உருகும் வளைவு (தூய்மையான சிகரங்களின் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கம்)
【வழக்கு பகுப்பாய்வு】

ஒரு முக்கிய உச்சம் உள்ளது, ஆனால் ப்ரைமர் டைமர் தீவிரமானது
கீழே உள்ள படத்தில் உள்ள ஒற்றை உச்ச உருகும் வளைவு உங்கள் கண்களை எளிதில் ஏமாற்றலாம், இது ஒரு சரியான பரிசோதனை என்று நினைத்து, ஆனால் விளைவு முற்றிலும் தவறானது.இந்த நேரத்தில், நாம் உருகும் வெப்பநிலையைப் பார்க்க வேண்டும்.உச்ச வெப்பநிலை 80 ° C க்கும் குறைவாக உள்ளது, இது முற்றிலும் ப்ரைமர்-டைமர் ஆகும்.

இலக்கு துண்டு இல்லை, அனைத்து ப்ரைமர் டைமர்களும்
இங்கே, என் தம்பி நிறுத்த முடியாது.கீழே உள்ள படம் ஒரு அசிங்கம் எனக்கு அனுப்பிய மொபைல் போனில் எடுக்கப்பட்ட புகைப்படம்.அவர் பயன்படுத்திய எதிர்வினைகள் அனைத்தும் தொழில்துறையில் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் பிராண்டுகள்.அவர் ஒரு டி-பிரிஃபிக்ஸ் பிராண்டிலிருந்து மற்றொரு டி-பிரிஃபிக்ஸ் பிராண்டிற்கு மாறினார்.நீங்கள் ஏற்கனவே யூகித்திருப்பீர்கள் என்று நினைக்கிறேன்.அந்த அசிங்கமானவன் என்னிடம் அழுதான்: “முதல் படத்தில் பயன்படுத்தப்பட்ட ரீஜென்ட் மிகவும் நன்றாக இருக்கிறது, உச்சம் ஒற்றையாக உள்ளது.பின்னர், நீங்கள் பரிந்துரைத்த மறுஉருவாக்கத்தைப் பயன்படுத்திய பிறகு, அது கலவையான சிகரங்களுடன் இரண்டாவது படம் போல மாறும்.நீ என்னைத் துன்புறுத்தி விட்டாய்."
இரண்டு வரைபடங்களையும் பிரிக்கவும்.முதல் பார்வையில், ஒன்று ஒற்றை உச்சம், மற்றொன்று இரட்டை உச்சம்.முட்டாள்தனம், ஒற்றை உச்சம் நிச்சயமாக நன்றாக இருக்கிறது.அது உண்மையா?
Dou E ஐ விட மோசமானது, கீழே உள்ள படத்தில் உள்ள இரண்டு படங்களையும் வைத்தால், உங்களுக்கு உடனடியாக புரியும்.உண்மையில், இந்த மாதிரியான படங்களால் நாம் எளிதில் முடங்கிவிடுகிறோம்.கவனமாக பகுப்பாய்வு செய்த பிறகு, நாங்கள் கண்டறிந்தோம்: முதல் உருவத்தின் உச்சம் 75 ° C இல் உள்ளது, இது முற்றிலும் ப்ரைமர் டைமர் ஆகும்;இரண்டாவது உருவத்தின் உச்சம் 75 டிகிரி செல்சியஸ் மற்றும் 82 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் தோன்றும், குறைந்தபட்சம் தயாரிப்பு தோன்றும்.

மாணவர்களின் கருத்துகளின் படங்கள்
எனவே அடிப்படைப் பிரச்சனை உலைகளின் பிரச்சனை அல்ல, ஆனால் ப்ரைமர் வடிவமைப்பின் பிரச்சனை.அதே நேரத்தில், சில பெரிய பிராண்டுகள் இரும்புத் தரத்தில் இல்லை என்பதையும் இது நிரூபிக்கிறது, மேலும் எனது சகோதரர் முன்பு கூறியதை இது நிரூபிக்கிறது: இது உங்கள் கட்டுரையை ஆதரிக்கும் ரியாஜென்ட் பிராண்ட் அல்ல.உங்களின் கட்டுரைதான் உதிரிபாகங்களின் முத்திரையை உயர்த்தியது.கற்பனை செய்து பாருங்கள், அசுத்தம் எதிர்வினைகளை மாற்றவில்லை என்றால், தவறான தரவு பத்திரிகைக்கு அனுப்பப்படும், மேலும் என்ன நடக்கும் என்பது ஒரு சோகமாக இருக்கும்.
2. வெற்றுக் கட்டுப்பாட்டின் Ct மதிப்பு
விளக்க வேண்டாம், வெற்றுக் கட்டுப்பாட்டில் Ct மதிப்பு இருந்தால், அது மாசுபாடு அல்லவா?இருப்பினும், எந்த வெற்று கட்டுப்பாடு Ct மதிப்பைக் கொண்டுள்ளது என்பதை நீங்கள் இன்னும் புரிந்து கொள்ள வேண்டும்.NTC என்றால், ரியாஜென்ட் மாசுபாடு போன்ற வெளிநாட்டு DNA உள்ளது என்று அர்த்தம்.என்ஆர்டி என்றால், பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏவில் டிஎன்ஏ மாசு உள்ளது என்று அர்த்தம்.
3. நிலையான வளைவு
சாய்வு மற்றும் கணக்கீட்டு சூத்திரம் உட்பட, PCR செயல்திறனை சூத்திரத்தின் மூலம் கணக்கிடலாம்.ஒரு சரியான பரிசோதனைக்கு நிலையான வளைவின் சாய்வு 3.32ஐ அணுகவும், R² 0.9999ஐ அணுகவும் தேவைப்படுகிறது.
4. நேரியல் மாறும் வரம்பு
எதிர்வினையின் மாறும் வரம்பு நேரியல் ஆகும்.நிலையான வளைவை உருவாக்கப் பயன்படுத்தப்படும் டெம்ப்ளேட்டின் படி, டைனமிக் வரம்பில் குறைந்தது 5 செறிவு சாய்வுகள் இருக்க வேண்டும், மேலும் அதிக செறிவு சாய்வு மற்றும் குறைந்த செறிவு சாய்வுகளில் Ct மதிப்புகளின் மாற்றத்திற்கு கவனம் செலுத்த வேண்டும்.
5. கண்டறிதல் துல்லியம்
qPCR முடிவுகளில் ஏற்படும் மாற்றங்கள், அதாவது, மோசமான மறுநிகழ்வு, அதாவது, மோசமான துல்லியம், வெப்பநிலை, செறிவு மற்றும் செயல்பாடு உள்ளிட்ட பல காரணிகளால் ஏற்படுகிறது.qPCR துல்லியமானது, நகல் எண் குறைவதால் பொதுவாகக் குறைவாகக் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது.சோதனை மாறுபாட்டிற்குள், இந்த தொழில்நுட்ப மாறுபாடு உயிரியல் மாறுபாட்டிலிருந்து வேறுபட்டதாக இருக்க வேண்டும், மேலும் உயிரியல் பிரதிகள் குழுக்கள் அல்லது சிகிச்சைகள் இடையே qPCR முடிவுகளில் புள்ளியியல் வேறுபாடுகளை நேரடியாக நிவர்த்தி செய்யலாம்.குறிப்பாக கண்டறியும் மதிப்பீடுகளுக்கு, தளங்கள் மற்றும் ஆபரேட்டர்கள் முழுவதும் சிறந்த இடை-மதிப்பீட்டு துல்லியம் (மீண்டும் மீண்டும் செய்யக்கூடியது) தெரிவிக்கப்பட வேண்டும்.
6. கண்டறிதல் திறன் மற்றும் LOD (மல்டிபிளக்ஸ் qPCR இல்)
கண்டறியப்பட்ட நேர்மறை மாதிரிகளில் 95% குறைந்த செறிவு LOD ஆகும்.வேறு வார்த்தைகளில் கூறுவதானால், இலக்கு மரபணு பிரதிகளின் தொகுப்பில் உள்ள LOD இன் செறிவு தோல்வியுற்ற எதிர்வினைகளில் 5% ஐ விட அதிகமாக இருக்கக்கூடாது.மல்டிபிளக்ஸ் qPCR பகுப்பாய்வு செய்யும் போது, ​​குறிப்பாக புள்ளி பிறழ்வுகள் அல்லது பாலிமார்பிஸங்களை ஒரே நேரத்தில் கண்டறிவதற்கு, மல்டிபிளக்ஸ் qPCR ஆனது ஒரே குழாயில் பல இலக்கு துண்டுகளின் துல்லியம் சமரசம் செய்யப்படவில்லை என்பதற்கான சான்றுகளை வழங்க வேண்டும், பல கண்டறிதல் மற்றும் ஒற்றை குழாய் கண்டறிதல் செயல்திறன் மற்றும் LOD ஆகியவை ஒரே மாதிரியாக இருக்க வேண்டும்.குறிப்பாக அதிக செறிவு இலக்கு மரபணுக்கள் மற்றும் குறைந்த செறிவு இலக்கு மரபணுக்கள் ஒரே நேரத்தில் பெருக்கப்படும் போது, ​​இந்த பிரச்சனைக்கு கவனம் செலுத்தப்பட வேண்டும்.
பிரச்சனைகள் மற்றும் தீர்வுகள்பொதுவாக, qPCR பிழைத்திருத்தத்தில் அடிக்கடி சந்திக்கும் சிக்கல்கள் பின்வரும் அம்சங்களில் கவனம் செலுத்துகின்றன:
· குறிப்பிடப்படாத பெருக்கம்
ப்ரைமர் செறிவின் கடினமான தேர்வு மற்றும் ப்ரைமர்-டைமர்களில் சிக்கல்
· அனீலிங் வெப்பநிலை துல்லியமாக இல்லை
· இரண்டாம் நிலை அமைப்பு பெருக்க செயல்திறனை பாதிக்கிறது
குறிப்பிடப்படாத பெருக்கம்
குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கம்ப்ரைமர் வடிவமைப்பு பொருத்தமானதல்லவா என்பது பொதுவாகக் கருதப்படுகிறது, ஆனால் ப்ரைமர்களை மாற்ற நீங்கள் அவசரப்படாவிட்டால், முதலில் பின்வரும் முறைகளை முயற்சி செய்யலாம் (கொள்கையும் இணைக்கப்பட்டுள்ளது):
· அனீலிங் வெப்பநிலையை அதிகரிக்கவும் - பலவீனமான ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகளை பராமரிக்க முடியாமல் செய்ய முயற்சிக்கவும்;
· அனீலிங் மற்றும் நீட்டிப்பு நேரத்தை சுருக்கவும் - பலவீனமான ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகளின் வாய்ப்பைக் குறைக்கவும்;
·ப்ரைமர் செறிவைக் குறைத்தல் - தேவையற்ற ப்ரைமர்கள் மற்றும் இலக்கு அல்லாத பகுதிகளின் பிணைப்பு வாய்ப்பைக் குறைக்கிறது;
குறைந்த பெருக்க திறன்
குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்திற்கு எதிர் நிலைமை - குறைந்த பெருக்க செயல்திறன் மற்றும் குறைந்த பெருக்க செயல்திறனைக் கையாள்வதற்கான நடவடிக்கைகள் இதற்கு நேர்மாறானது:
· அனீலிங் மற்றும் நீட்டிப்பு நேரத்தை நீடிக்கவும்;
·மூன்று-படி PCR க்கு மாற்றவும் மற்றும் அனீலிங் வெப்பநிலையைக் குறைக்கவும்;
ப்ரைமர் செறிவை அதிகரிக்கவும்;
Ps: 90 களில் பிறந்த பல பட்டதாரி மாணவர்கள் சோதனைகளை எவ்வாறு பிழைத்திருத்துவது என்பதைப் படிக்கத் தயாராக இல்லை, மேலும் கிட் சிக்கலை முழுவதுமாக தீர்க்கும் என்று நம்புகிறேன் (பட்டப்படிப்புக்குப் பிறகு ஆராய்ச்சி மற்றும் மேம்பாடு செய்ய நீங்கள் ஒரு ரியாஜென்ட் நிறுவனத்திற்குச் செல்ல விரும்பினால்), உண்மையில், வினையூக்கி உற்பத்தியாளர்களும் இப்படி நினைக்கிறார்கள், இது ஒரு முட்டாள்தனம் என்று நம்புகிறேன். பலவீனமான H- பிணைப்பு உறிஞ்சுதல் காரணிகள்.சிக்கலை எளிதில் தீர்க்க, பலவீனமான ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகளை உறிஞ்சும் காரணி உள்ளதா என்பதைப் பார்க்க, ரியாஜெண்ட் நிறுவனத்தின் அறிமுகத்தை முட்டாள்கள் இன்னும் படிக்க வேண்டும்.
ப்ரைமர் செறிவின் கடினமான தேர்வு மற்றும் ப்ரைமர்-டைமர்களில் சிக்கல்
முறை 1: பொதுவாக, qPCR க்கான கிட் வழிமுறைகள் பரிந்துரைக்கப்பட்ட அமைப்புகள் மற்றும் பரிந்துரைக்கப்பட்ட ப்ரைமர் செறிவுகளைக் கொண்டுள்ளன.
முறை 2: ப்ரைமர் செறிவு சாய்வை அமைப்பதன் மூலம் பிழைத்திருத்தம்.கீழே உள்ள படம் விளக்குவதற்கு ஒரு நிறுவனத்திடமிருந்து திருடப்பட்டது.மூன்று ப்ரைமர் செறிவு சாய்வுகள் (100nM, 250nM, 500nM) மற்றும் நான்கு டெம்ப்ளேட் செறிவு சாய்வுகள் (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) மூலம் செய்யப்பட்ட ஒளிரும் அளவு முடிவுகளை கீழே உள்ள படம் காட்டுகிறது.சோதனை முடிவுகளின் Ct மதிப்பு பின்வருமாறு திட்டமிடப்பட்டுள்ளது:

ப்ரைமர் செறிவு தேர்வு ஒவ்வொரு ப்ரைமர் செறிவையும் ஒரு வரியில் பின்வருமாறு இணைக்கவும்:

ப்ரைமர் செறிவின் தேர்வு வெளிப்படையானது, 100nM மற்றும் 250nM இன் ப்ரைமர் செறிவின் நேரியல் உறவு சிறந்தது, மேலும் 500nM இன் ப்ரைமர் செறிவின் நேரியல் உறவு ஒப்பீட்டளவில் மோசமாக உள்ளது.100nM மற்றும் 250nM இல், 250nM இன் Ct மதிப்பு ஒப்பீட்டளவில் சிறியது, எனவே உகந்த ப்ரைமர் செறிவு 250nM ஆகும்.பொதுவாக கடுமையான ப்ரைமர்-டைமர்களை உருகும் வளைவில் காணலாம்.வடிவமைக்கப்பட்ட ப்ரைமர்கள் ப்ரைமர்-டைமர்களைத் தவிர்க்க முடியாவிட்டால் என்ன செய்வது?
முறை 3: ப்ரைமர்களின் அளவைக் குறைத்து, அனீலிங் வெப்பநிலையை அதிகரிக்கவும் (விளக்க வேண்டிய அவசியமில்லை).
அனீலிங் வெப்பநிலையின் அனுபவ மதிப்பு 60 டிகிரி செல்சியஸ் ஆகும்.உங்களுக்குத் தெரியாவிட்டால், மிகவும் பொருத்தமான அனீலிங் வெப்பநிலையை எவ்வாறு தேர்ந்தெடுப்பது?ப்ரைமர் செறிவூட்டலின் தேர்வைப் போலவே பதில் உள்ளது -சாய்வு சோதனை.சிக்கலை விளக்க Bio-rad நிறுவனத்திடமிருந்து ஒரு படத்தை எடுக்கவும்.ஒரு குறிப்பிட்ட இலக்கு துண்டின் பெருக்கத்திற்கு, எட்டு வெப்பநிலை சாய்வுகளை அமைக்கவும், ஒவ்வொன்றும் மூன்று மறுபடியும் மறுபடியும், மற்றும் பெறப்பட்ட பெருக்க வளைவு பின்வருமாறு:

அனீலிங் வெப்பநிலை தேர்வு:
·70°C, 69°C-அடிப்படையில், ப்ரைமர்களை இணைக்க முடியாது, அதனால் எந்தப் பெருக்கமும் இல்லை.
·67.3°C - தொடக்கத்தில் ஒரு சிறிய அளவு பெருக்கம் உள்ளது, மேலும் Ct மதிப்பு ஒப்பீட்டளவில் பெரியது.
·64.5°C——Ct மதிப்பு குறைகிறது.
60.7°C, 58.0°C, 56.2°C மற்றும் 55.0°C இல், Ct மதிப்புகள் அடிப்படையில் நிலையானதாக இருக்கும், ஆனால் இறுதி ஒளிர்வு மதிப்புகள் வேறுபட்டன.
எப்படி தேர்வு செய்வது?கொள்கை: முதல் கொள்கை அதிக Ct மதிப்பு.அதே Ct மதிப்புக்கு, டைமரைசேஷன் மற்றும் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்தைத் தவிர்க்க அதிக அனீலிங் வெப்பநிலையைத் தேர்வு செய்யவும்.55 ° C இல் அதிக ஒளிரும் மதிப்பு இருந்தாலும், அதில் டைமர்கள் அல்லது குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கம் இருக்கலாம்.
ஆனால் நீங்கள் உங்களைப் போன்ற புத்திசாலியாக இருந்தால், நீங்கள் நிச்சயமாக நினைப்பீர்கள்: தர்க்கரீதியாகப் பேசினால், PCR எதிர்வினை மிகவும் குறிப்பிட்டதாக இருந்தால், ப்ரைமர் செறிவு குறைந்தபட்சத் தேவையை மீறும் வரை, ஃப்ளோரசன்ட் சாயங்கள் மற்றும் dNTP கள் போன்ற உயர் மற்றும் குறைந்த புள்ளிகள் எந்த விளைவையும் ஏற்படுத்தாது.உண்மையில், அனீலிங் வெப்பநிலை சரியாக உகந்ததாக இருக்கும் வரை, Ct மதிப்பில் ப்ரைமர் செறிவின் விளைவு இயற்கையாகவே குறைக்கப்படும்.

அனீலிங் வெப்பநிலை சரியாக உகந்ததாக உள்ளது, மேலும் CT இல் ப்ரைமர் செறிவின் விளைவு குறைக்கப்படும்
இரண்டாம் நிலை அமைப்பு பெருக்க செயல்திறனை பாதிக்கிறது
சிக்கலை விளக்குவதற்கு Bio-rad இலிருந்து படத்தை எடுக்கலாம்.இது இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பைக் கொண்ட ஒரு மரபணுவை பெருக்க வெப்பநிலை சாய்வையும் வடிவமைக்கிறது.

இரண்டாம் நிலை அமைப்பு உருவாகிறது
வெப்பநிலை சாய்வு குறையும் போது, ​​தயாரிப்புகள் தோன்றத் தொடங்குகின்றன மற்றும் Ct மதிப்பு முன்னோக்கி நகர்கிறது, குறைந்தபட்ச மதிப்பான 60.7 ° C ஐ அடைகிறது, பின்னர் வெப்பநிலை சாய்வு குறையும் போது, ​​Ct மதிப்பு பெரிதாகிறது.மாறாக, வெப்பநிலை அதிகரிக்கும் போது, ​​இரண்டாம் நிலை அமைப்பு திறக்கிறது மற்றும் பெருக்க திறன் அதிகரிக்கிறது.ஒரு குறிப்பிட்ட வெப்பநிலையை அடைந்த பிறகு, வெப்பநிலையை அதிகரிப்பதன் மூலம் பெருக்க செயல்திறனை மேம்படுத்த முடியாது.ஏனெனில் இந்த நேரத்தில் ப்ரைமர்களை நிலையாக இணைக்க முடியாது.எனவே,குறைந்த Ct மதிப்பு கொண்ட வெப்பநிலையைப் பார்க்கவும், இது இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பு டெம்ப்ளேட்டைப் பெருக்குவதற்கான சிறந்த வெப்பநிலை!நிச்சயமாக, புத்திசாலித்தனமான முட்டாள்கள் அவசியம் இல்லை என்றால், ப்ரைமர்களை மாற்றுவது மற்றும் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பைத் தவிர்ப்பது சிறந்தது என்பதை அறிந்திருக்க வேண்டும்.
5. விண்ணப்ப நிலை
MIQE - தரவு பகுப்பாய்வு

தரவு பகுப்பாய்வு முக்கியமாக ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR கருவியால் வழங்கப்படுகிறது.முந்தைய கட்டுரையில், சோதனையின் வடிவமைப்பில் விளக்கப்பட்டுள்ள வெற்று கட்டுப்பாடு போன்ற தரவு பகுப்பாய்வு பணிகள் நிறைய செய்யப்பட்டுள்ளன.உள் குறிப்பு மரபணுக்கள், மீண்டும் வரும் எண்கள் போன்றவை தெளிவுபடுத்தப்பட்டுள்ளன., இங்கே நாம் முக்கியமாக qPCR இன் பயன்பாட்டை விளக்குகிறோம்.
qPCR பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் சோதனை சரிபார்ப்பு மற்றும் நியூக்ளிக் அமிலம் கண்டறிதல் ஆகியவை பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் காட்சிகளாகும்.
முழுமையான அளவீடு
பதிவு (ஆரம்ப செறிவு) சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையுடன் நேரியல் உறவைக் கொண்டுள்ளது.அறியப்பட்ட ஆரம்ப நகல் எண்ணைக் கொண்ட தரநிலையிலிருந்து ஒரு நிலையான வளைவை வரையலாம், அதாவது பெருக்க வினையின் நேரியல் உறவைப் பெறலாம்.மாதிரியின் Ct மதிப்பின் படி, மாதிரியின் செறிவைக் கணக்கிடலாம்.சேர்க்க வேண்டிய டெம்ப்ளேட்களின் அளவு.

முழுமையான அளவு கணக்கீட்டு முறை
முழுமையான அளவீடு நிலையான வளைவின் அடிப்படையில் இருக்க வேண்டும்.ஒரு நிலையான வளைவை உருவாக்க, ஒரு தரநிலை தேவைப்படுகிறது.வழக்கமாக, நிலையானது இலக்கு மரபணுவை குளோனிங் செய்வதன் மூலம் பெறப்பட்ட பிளாஸ்மிட் ஆகும்.அது ஏன் பிளாஸ்மிட்?ஏனெனில் வட்ட பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ மிகவும் நிலையானது.இரட்டிப்பு விகிதத்தின் (10-மடங்கு நீர்த்தல்) படி நிலையான தயாரிப்பை 5 முதல் 6 சாய்வுகளில் நீர்த்துப்போகச் செய்யுங்கள், மேலும் நீர்த்தும்போது சீரான தன்மைக்கு கவனம் செலுத்துங்கள்.Ct மதிப்பு 15-30க்கு இடையில் குறையட்டும்.

நிலையான தயாரிப்பு
அதே நேரத்தில், பரிசோதிக்கப்பட வேண்டிய மாதிரியும் அதற்கேற்ப நீர்த்தப்பட வேண்டும் (நீர்த்த காரணியை நினைவில் கொள்க), மேலும் Ct மதிப்பும் 15-30க்கு இடையில் குறைய வேண்டும்.நிலையான தயாரிப்பு + சோதிக்கப்பட வேண்டிய மாதிரி ஒன்றாக இயந்திரத்தில் வைக்கப்படும்.ஓட்டத்திற்குப் பிறகு, நிலையான பொருளைக் கொண்டு ஒரு நிலையான வளைவு செய்யப்பட்டது, மேலும் செறிவைக் கணக்கிடுவதற்கு சோதிக்கப்பட வேண்டிய மாதிரிகள் நிலையான வளைவில் கொண்டு வரப்பட்டன.
ஹெபடைடிஸ் பி வைரஸ் HBV அளவீடு என்பது ஒரு பொதுவான முழுமையான அளவீடு ஆகும், இது 1ml இரத்தத்தில் வைரஸ் நகல் எண்ணைக் கணக்கிட முடியும்.
நகல் எண்ணின் கணக்கீடு
சோதிக்கப்பட வேண்டிய மாதிரி செறிவு (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × நீர்த்த காரணி
மாதிரி மூலக்கூறு எடை = தளங்களின் எண்ணிக்கை × 324
சோதிக்கப்பட வேண்டிய மாதிரியின் நகல் எண் (நகல்கள்/உல்) = சோதிக்கப்பட வேண்டிய மாதிரியின் செறிவு / மாதிரியின் மூலக்கூறு எடை × 6 × 1014

நகல் எண்ணைக் கணக்கிடும் முறை

மேலே உள்ளவை அளவை நிர்ணயிப்பதற்கான கணக்கீட்டு முறை.இது ஜூனியர் உயர்நிலைப் பள்ளியில் பட்டம் பெற்ற பிறகு தீர்க்கப்படக்கூடிய ஒரு கணிதச் சிக்கலாகும், மேலும் கணிதச் சிக்கல்கள் பொதுவாக கணினிகளால் தீர்க்கப்படுகின்றன.உங்களுக்கு புரியவில்லை என்றால், நீங்கள் தொடர்பு கொள்ள வரலாம்.
உறவினர் அளவீடு
உறவினர் அளவீடு முக்கியமாக அறிவியல் ஆராய்ச்சியில் பயன்படுத்தப்படுகிறது.1 மில்லி இரத்தத்தில் எத்தனை வைரஸ்கள் உள்ளன, அது ஒரு டிஎன்ஏ வைரஸ், இது ஒப்பீட்டளவில் தீர்மானிக்கும் நிகழ்வு: இரத்தத்தின் அளவை தீர்மானிக்க முடியும், மேலும் டிஎன்ஏ வைரஸ் ஒப்பீட்டளவில் நிலையானது.இருப்பினும், ஒரு இலையில் உள்ள ஒரு குறிப்பிட்ட மரபணுவின் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் நகல்களின் எண்ணிக்கையை ஒப்பிடுவது கடினம், ஏனென்றால் இலையின் அளவு, எடை மற்றும் மென்மை ஆகியவற்றைக் கண்டறிவது கடினம், பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏ அளவைக் கண்டறிவது கடினம், மற்றும் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் செயல்திறனைக் கண்டறிவது கடினம், அதாவது, எந்த படியிலும் சோதனை தரவுகளைப் பயன்படுத்த முடியாது.
எனவே, ஒப்பீட்டு அளவீடு ஒரு உறுப்பை அறிமுகப்படுத்த வேண்டும்:உள் குறிப்பு மரபணு.
வேறு வார்த்தைகளில் கூறுவதானால், உறவினர் அளவீடு என்பது இலக்கு மரபணு மற்றும் உள் குறிப்பு மரபணு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான ஒப்பீடு ஆகும்.ஒரே திசு மற்றும் அதே கலத்தில் ஒப்பிடும்போது, ​​மாதிரி அளவு, ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல் அளவு, தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்திறன் மற்றும் PCR செயல்திறன் ஆகியவற்றின் தாக்கம் ஒப்பீட்டளவில் சிறியது.சிறிய மாதிரி அளவு காரணமாக, உள் குறிப்பு மரபணுக்கள் மற்றும் இலக்கு மரபணுக்கள் இரண்டும் ஒப்பீட்டளவில் குறைக்கப்பட்டன.இதனால்தான் ஒற்றுமை மற்றும் ஸ்திரத்தன்மையை முன்னரே வலியுறுத்தி வருகிறோம்.
உள் குறிப்பு மரபணுக்கள் பொதுவாக உள்ளனவீட்டு பராமரிப்பு மரபணுக்கள்(ஹவுஸ்-கீப்பிங் மரபணுக்கள்), இது அனைத்து உயிரணுக்களிலும் நிலையானதாக வெளிப்படுத்தப்படும் மரபணுக்களின் வகுப்பைக் குறிக்கிறது, மேலும் அவற்றின் தயாரிப்புகள் உயிரணுக்களின் அடிப்படை வாழ்க்கை நடவடிக்கைகளை பராமரிக்க அவசியம்.
இந்த கருத்தை குழப்ப வேண்டாம்.வீட்டு பராமரிப்பு மரபணுக்கள் உயிரியல் செயல்பாட்டு சொற்கள், உள் குறிப்பு மரபணுக்கள் சோதனை தொழில்நுட்ப சொற்கள்.வீட்டு பராமரிப்பு மரபணுக்கள் உள் குறிப்பு மரபணுக்களாக தேர்ந்தெடுக்கப்படுவதற்கு முன் சரிபார்ப்பை அனுப்ப வேண்டும்.
எடுத்துக்காட்டாக, வெவ்வேறு திசு உயிரணுக்களில் அவற்றின் வெளிப்பாடு நிலைகளைச் சோதிக்க கீழே உள்ள படத்தில் பல வீட்டு பராமரிப்பு மரபணுக்களைத் தேர்ந்தெடுத்தோம், மேலும் β-2-மைக்ரோகுளோபுலின் வெளிப்பாடு நிலைகள் மற்ற மூன்று மரபணுக்களில் இருந்து முற்றிலும் வேறுபட்டது, எனவே அவற்றை உள் குறிப்பு மரபணுக்களாகப் பயன்படுத்த முடியாது.

உள் குறிப்பு மரபணுவின் சரிசெய்தல் செயல்பாட்டைப் புரிந்துகொண்ட பிறகு, உள் குறிப்பு மரபணுவின் அறிமுகம் காரணமாக இரண்டு வழிமுறைகள் பெறப்படுகின்றன.
· இரட்டை நிலையான வளைவு முறை
·2 – △△Ct முறை (CT மதிப்பு ஒப்பீட்டு முறை)
இனங்கள் மற்றும் மரபணு செயல்பாடுகளைப் படிப்பதில் நீங்கள் ஆர்வமாக இருந்தால், அல்காரிதம்கள் பற்றிய ஆராய்ச்சியை கைவிட்டு, சூத்திரங்களை நேரடியாகப் பயன்படுத்தவும் அல்லது இயந்திரங்களை நேரடியாகப் பயன்படுத்தவும்;நீங்கள் கணிதம் மற்றும் பொறியியலில் நேரடியான நபராக இருந்தால், தயவுசெய்து தயங்க வேண்டாம்.
இரட்டை நிலையான வளைவு முறை
கட்டுப்பாட்டு மாதிரியின் இலக்கு மரபணு மற்றும் வீட்டு பராமரிப்பு மரபணு மற்றும் நிலையான வளைவு மூலம் சோதிக்கப்பட வேண்டிய மாதிரி ஆகியவற்றை அளவிடவும், பின்னர் கணக்கீட்டு சூத்திரத்தின்படி ஒப்பீட்டு மதிப்பைக் கணக்கிடவும், இது ஒப்பீட்டு வெளிப்பாடு நிலை.
நன்மைகள்: எளிய பகுப்பாய்வு, ஒப்பீட்டளவில் எளிமையான சோதனை தேர்வுமுறை
குறைபாடு: ஒவ்வொரு மரபணுவிற்கும், ஒவ்வொரு சுற்று சோதனைகளும் ஒரு நிலையான வளைவை உருவாக்க வேண்டும்
பயன்பாடு: மரபணு வெளிப்பாடு ஒழுங்குமுறை ஆய்வில் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் மற்றும் அங்கீகரிக்கப்பட்ட ஒப்பீட்டு அளவு முறைகளில் ஒன்று
சூத்திரம் பின்வருமாறு:

எடுத்துக்காட்டுகள் பின்வருமாறு:

அளவு முடிவின் அடிப்படையில் தொடர்புடைய தொகையைக் கணக்கிடுங்கள்
2 – △△Ct முறை (CT மதிப்பு ஒப்பீட்டு முறை)

நன்மைகள்: நிலையான வளைவை உருவாக்க வேண்டிய அவசியமில்லை
குறைபாடுகள்: பெருக்க திறன் 100%க்கு அருகில் இருப்பதாகக் கருதப்படுகிறது;நிலையான விலகல் <5%, மேலும் நிலையான வளைவு மற்றும் ஒவ்வொரு பெருக்கத்திற்கும் இடையே உள்ள செயல்திறன் ஆகியவை சீரானதாகக் கருதப்படுகிறது;சோதனை நிலைமைகளின் தேர்வுமுறை மிகவும் சிக்கலானது.
பயன்பாடு: மரபணு வெளிப்பாடு ஒழுங்குமுறை ஆய்வில் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் மற்றும் அங்கீகரிக்கப்பட்ட ஒப்பீட்டு அளவு முறைகளில் ஒன்று

நிச்சயமாக, பெருக்க செயல்திறன் பொதுவாக சாத்தியமற்றது 1. திருத்தும் முறை: இலக்கு மரபணுவும் குறிப்பு மரபணுவும் ஒரே பெருக்க செயல்திறனைக் கொண்டிருக்கின்றன, ஆனால் பெருக்க திறன் 1 க்கு சமமாக இல்லை என்று நமக்குத் தெரிந்தால், 2－△△Ct ஐ இவ்வாறு சரிசெய்யலாம்: (1+E )－△ எடுத்துக்காட்டாக. கணக்கீட்டு சூத்திரத்தை 1.95△△Ct என திருத்தலாம்
இதுவரை, ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR பற்றிய உள்ளடக்கம் முடிவுக்கு வந்துவிட்டது.