நெடுவரிசை செருகப்பட்டது

நெடுவரிசை செருகப்பட்ட பிறகு, ஆர்என்ஏ விளைச்சல் குறைக்கப்படுகிறது அல்லது ஆர்என்ஏவை சுத்திகரிக்க இயலாது, மேலும் பெறப்பட்ட ஆர்என்ஏ நிறை குறைவாக உள்ளது.

பொதுவான காரண பகுப்பாய்வு:

1. மாதிரி இடைவெளிகள் முழுமையாக இல்லை.

மாதிரி உடைப்பு டிஎன்ஏ-சுத்தப்படுத்தும் நெடுவரிசையை முழுமையாகத் தடுக்காது, அதே நேரத்தில் ஆர்என்ஏ மகசூல் மற்றும் தரத்தை பாதிக்கிறது.மாதிரிகளை உடைக்கும் போது போதுமான திரவ நைட்ரஜனில் விரைவான அரைக்கும் செயல்பாட்டை பரிந்துரைக்கிறோம், மாதிரி செல் சுவர், செல் சவ்வு மற்றும் பிற திசுக்களை நசுக்க முயற்சிக்கவும்.பாலியோல் பாலிசாக்கரைடுகளின் தாவர மாதிரிகளுக்கு, தாவர மொத்த RNA ஐசோலேஷன் கிட் பிளஸைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம்.

2. டிஎன்ஏ-சுத்தப்படுத்தும் நெடுவரிசையுடன் பிரிக்கப்பட்ட மாதிரி சூப்பர்நேட்டன்ட்டை உறிஞ்சும் போது, ​​சாத்தியமான செல் துண்டு துண்டான வீழ்படிவு உள்ளிழுக்கப்படலாம்.

எடுக்கப்பட்ட செல் துண்டாக்கப்பட்ட படிவுகள் ஆர்என்ஏ-ஒன்லி நெடுவரிசையை ஏற்படுத்தும், இது ஆர்என்ஏ உறிஞ்சுதல் செயல்பாட்டின் போது தடுக்கப்படும் (படி 6 ஐப் பார்க்கவும்).செல் குப்பைகள் உறிஞ்சப்படுவதைத் தவிர்ப்பதற்காக, இந்த சூப்பர்நேட்டன்ட்டை உறிஞ்சும் போது கவனமாகப் பரிந்துரைக்கிறோம்.

3. மாதிரி ஆரம்ப தொகை அதிகமாக உள்ளது.

அதிகப்படியான மாதிரி பயன்பாடு, பஃபர் பிஎஸ்எல்1 மூலம் முழுமையற்ற மாதிரி துண்டு துண்டாக அல்லது முழுமையற்ற செல் சிதைவை ஏற்படுத்தும், இதன் விளைவாக சுத்திகரிப்பு போது சுத்திகரிப்பு நெடுவரிசையில் அடைப்பு ஏற்படும்.தாவர மொத்த RNA ஐசோலேஷன் கிட் ஒவ்வொரு சுத்திகரிக்கப்பட்ட இயக்க மாதிரியும் 50 மி.கி.பாலியோல் பாலிசாக்கரைடுகளின் தாவர மாதிரிகளுக்கு, தாவர மொத்த RNA ஐசோலேஷன் கிட் பிளஸை முயற்சிக்குமாறு பரிந்துரைக்கிறோம்.

4. மையவிலக்கின் வெப்பநிலை மிகவும் குறைவாக உள்ளது.

முழு ஆர்என்ஏ தனிமைப்படுத்தல் மற்றும் சுத்திகரிப்பு செயல்முறை அறை வெப்பநிலையில் மேற்கொள்ளப்படுகிறது (20-25°சி), மாதிரி திசு திரவ நைட்ரஜனால் உடைக்கப்படுவதைத் தவிர. சில கிரையோஜெனிக் மையவிலக்குகளின் வெப்பநிலை 20 க்கும் குறைவாக உள்ளது℃, இது டிஎன்ஏ-சுத்தப்படுத்தும் நெடுவரிசை மற்றும்/அல்லது ஆர்என்ஏ-மட்டும் நெடுவரிசையின் அடைப்பை ஏற்படுத்தலாம்.இது நடந்தால், மையவிலக்கு வெப்பநிலையை 20-25 ஆக அமைக்கவும்℃, மற்றும்லிசிஸ் கலவை மற்றும்/அல்லது எத்தனால் சேர்க்கப்பட்ட சூப்பர்நேட்டன்ட் 37 க்கு முன்கூட்டியே சூடேற்றப்பட்டதா என்பதை உறுதிப்படுத்தவும்°C.

ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுக்கப்படவில்லை அல்லது ஆர்என்ஏ விளைச்சல் குறைவாக இல்லை

மீட்புத் திறனைப் பாதிக்கும் பல காரணிகள் பொதுவாக உள்ளன, அவை: மாதிரி ஆர்என்ஏ உள்ளடக்கம், செயல்பாட்டு முறை, எலுஷன் அளவு போன்றவை.

கீழே உள்ள பொதுவான காரணங்களின் பகுப்பாய்வு:

1.ஆபரேஷனின் போது ஒரு பனி குளியல் அல்லது குறைந்த வெப்பநிலை (4°C) மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது.

பரிந்துரை: அறை வெப்பநிலையில் இயக்கவும் (15-25°C) முழு செயல்முறையிலும், பனி குளியல் மற்றும் குறைந்த வெப்பநிலை மையவிலக்கு செய்ய வேண்டாம்.

2. மாதிரியின் முறையற்ற பாதுகாப்பு அல்லது மாதிரியின் நீண்ட காலப் பாதுகாப்பின் காரணமாக ஆர்.என்.ஏ சிதைந்துள்ளது.

பரிந்துரை: புதிதாக சேகரிக்கப்பட்ட மாதிரிகள் திரவ நைட்ரஜனில் விரைவாக உறைந்து, பின்னர் -80 ° C இல் நீண்ட நேரம் சேமிக்கப்பட வேண்டும், மீண்டும் மீண்டும் உறைதல் மற்றும் உருகுவதைத் தவிர்க்கவும்;அல்லது உடனடியாக மாதிரிகளை ஆர்என்ஏ நிலைப்படுத்தி ஆர்என்ஏலேட்டர் கரைசலில் (விலங்கு மாதிரிகள்) ஊற வைக்கவும்.

3. போதிய மாதிரி துண்டாடுதல் மற்றும் சிதைவு ஆகியவை சுத்திகரிப்பு நெடுவரிசையின் அடைப்புக்கு வழிவகுக்கும்.

பரிந்துரை: திசுவை அரைக்கும் போது, ​​திசு போதுமான அளவு அரைக்கப்பட்டுள்ளதா என்பதை உறுதிசெய்து, அதை முன்கூட்டியே தயாரிக்கப்பட்ட பஃபர் பிஎஸ்எல்1க்கு விரைவாக மாற்றவும் (β-ME இன் சரியான விகிதம் சேர்க்கப்பட்டுள்ளதா என்பதை உறுதிப்படுத்தவும், செயல்முறையின் படி 1 ஐப் பார்க்கவும்).

4.எலுவென்ட் தவறாக சேர்க்கப்பட்டது.

பரிந்துரை: சுத்திகரிப்பு நெடுவரிசை சவ்வின் நடுவில் RNase-Free ddH2O சொட்டப்பட்டிருப்பதை உறுதிசெய்யவும்.

5.பஃபர் பிஎஸ்எல்2 அல்லது பஃபர் பிஆர்டபிள்யூ2 இல் முழுமையான எத்தனாலின் சரியான அளவு சேர்க்கப்படவில்லை.

பரிந்துரை: தயவுசெய்து வழிமுறைகளைப் பின்பற்றவும், பஃபர் பிஎஸ்எல்2 மற்றும் பஃபர் பிஆர்டபிள்யூ2 ஆகியவற்றில் முழுமையான எத்தனாலின் சரியான அளவைச் சேர்த்து, கிட்டைப் பயன்படுத்துவதற்கு முன்பு நன்கு கலக்கவும்.

6.திசு மாதிரியின் அளவு பொருத்தமற்றது.

பரிந்துரை: Buffer PSL1 இன் 500 μlக்கு 50 mg திசுக்களைப் பயன்படுத்தவும்.அதிகப்படியான திசுக்களைப் பயன்படுத்துவதால், பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏவின் அளவு குறையும், அதன் விளைவாக வரும் ஆர்என்ஏவின் தூய்மையும் குறையும்.ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுக்கும் செயல்பாட்டிற்கு ஆரம்ப மாதிரி டோஸ் 50 மி.கிக்கு மிகாமல் இருக்க வேண்டும் என்று நாங்கள் கடுமையாக பரிந்துரைக்கிறோம்.

7.பொருத்தமற்ற எலுஷன் அளவு அல்லது முழுமையற்ற எலுஷன்.

பரிந்துரை: சுத்திகரிப்பு நெடுவரிசையின் எலுவென்ட் அளவு 50-200 μl;நீக்குதல் விளைவு திருப்திகரமாக இல்லாவிட்டால், 5-10நிமிடங்கள் போன்ற முன்சூடாக்கப்பட்ட RNase-Free ddH2O ஐச் சேர்த்த பிறகு அறை வெப்பநிலையில் நேரத்தை நீட்டிக்க பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

8.சுத்திகரிப்பு பத்தியில் BufferPRW2 உடன் கழுவிய பின் எத்தனால் எச்சம் உள்ளது.

பரிந்துரை: வெற்றுக் குழாய் 1 நிமிடம் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டு, Buffer PRW2ல் கழுவிய பிறகும் எத்தனால் எஞ்சியிருந்தால், காலி ட்யூப் மையவிலக்கு நேரத்தை 2 நிமிடமாக அதிகரிக்கலாம் அல்லது மீதமுள்ள எத்தனாலை முழுமையாக அகற்ற அறை வெப்பநிலையில் 5 நிமிடம் சுத்திகரிப்பு நெடுவரிசையை வைக்கவும்.

9.கிட் தவறாக பயன்படுத்தப்பட்டது.

பரிந்துரை: பாலிபினோலிக் பாலிசாக்கரைடுகளின் தாவர மாதிரிகளுக்கு, தாவர மொத்த RNA ஐசோலேஷன் கிட் போன்ற பொதுவான கருவிகளைப் பயன்படுத்தி சிறந்த RNA மாதிரிகளைப் பெற முடியாமல் போகலாம்.பாலிபினோலிக் பாலிசாக்கரைடு தாவர மாதிரிகளுக்காக பிரத்யேகமாக வடிவமைக்கப்பட்ட தாவர மொத்த RNA ஐசோலேஷன் கிட் பிளஸைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கிறோம்.பாலிஃபீனால் மற்றும் பாலிசாக்கரைடு தாவர மாதிரிகளிலிருந்து ஆர்என்ஏவை பிரித்தெடுப்பதற்காக பிரத்யேகமாக உருவாக்கப்பட்ட ஒரு கிட்.

OD260/OD280 மதிப்பு குறைவாக உள்ளது

ddH2O உடன் RNA எலுஷன் மற்றும் ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டர் அளவீடுகளுக்குப் பயன்படுத்தப்படுவது குறைந்த OD260/OD280 மதிப்புகளில் விளைகிறது.ஒப்பீட்டளவில் சரியான OD260/OD280 மதிப்புகளைப் பெற, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 (ஆர்என்ஏவை நீக்குவதற்கு RNase-Free ddH2O ஐ விட) பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கிறோம், பக்கம் 19 இல் "RNA செறிவு மற்றும் சுத்திகரிப்பு மதிப்பீடுகள்" என்பதைப் பார்க்கவும்.

சுத்திகரிக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏ சிதைந்துள்ளது

சுத்திகரிக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏவின் தரமானது மாதிரி பாதுகாப்பு, ஆர்நேஸ் மாசுபாடு மற்றும் கையாளுதல் போன்ற காரணிகளுடன் தொடர்புடையது.

பொதுவான காரணங்களின் பகுப்பாய்வு:

1.திசு மாதிரிகள் சேகரிக்கப்பட்ட பிறகு சரியான நேரத்தில் சேமிக்கப்படவில்லை.

பரிந்துரை: திசு மாதிரிகள் சேகரிக்கப்பட்ட பிறகு சரியான நேரத்தில் பயன்படுத்தப்படாவிட்டால், அவற்றை உடனடியாக குறைந்த வெப்பநிலையில் திரவ நைட்ரஜனில் சேமிக்கவும் அல்லது திரவ நைட்ரஜனில் விரைவாக உறைந்த பிறகு நீண்ட கால சேமிப்பிற்காக அவற்றை -80 ° C க்கு மாற்றவும் அல்லது உடனடியாக ஆர்என்ஏ நிலைப்படுத்தி ஆர்என்ஏலேட்டர் கரைசலில் (விலங்கு மாதிரிகள்) அமிழ்த்தவும்.ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுப்பதற்கு, புதிதாக சேகரிக்கப்பட்ட திசு மாதிரிகளைப் பயன்படுத்த முயற்சிக்கவும்.

2.திசு மாதிரிகள் மீண்டும் மீண்டும் உறைதல் மற்றும் கரைதல்.

ஆலோசனை: திசு மாதிரிகளை சேமிக்கும் போது, ​​அவற்றைப் பாதுகாப்பதற்காக சிறிய துண்டுகளாக வெட்டி, அவற்றைப் பயன்படுத்தும் போது, ​​மீண்டும் மீண்டும் உறைதல் மற்றும் உருகுவதால் ஏற்படும் ஆர்என்ஏ சிதைவைத் தவிர்க்க, அவற்றின் ஒரு பகுதியை வெளியே எடுப்பது நல்லது.

3.RNase அறுவை சிகிச்சை அறையில் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டது அல்லது செலவழிப்பு கையுறைகள், முகமூடிகள் போன்றவற்றை அணியவில்லை.

பரிந்துரை: ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல் பரிசோதனைகள் தனித்தனி ஆர்என்ஏ செயல்பாடுகளில் சிறப்பாக செய்யப்படுகின்றன, மேலும் பரிசோதனைக்கு முன் ஆய்வக மேசையை சுத்தம் செய்ய வேண்டும், மேலும் ஆர்என்ஏஸ் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டதால் ஏற்படும் ஆர்என்ஏ சிதைவைத் தவிர்க்க சோதனையின் போது பயன்படுத்தப்படும் கையுறைகள் மற்றும் முகமூடிகளை அணிய வேண்டும்.

4.பயன்படுத்தும் போது RNase மூலம் மறுஉருவாக்கம் மாசுபடுகிறது.

பரிந்துரை: தொடர்புடைய சோதனைகளுக்கு தாவர மொத்த ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல் கருவிகளின் புதிய தொடரை மாற்றவும்.

5.ஆர்என்ஏ கையாளுதலுக்கு பயன்படுத்தப்படும் மையவிலக்கு குழாய்கள் மற்றும் பைபெட் குறிப்புகள் RNase உடன் மாசுபட்டுள்ளன.

பரிந்துரை: ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தலில் பயன்படுத்தப்படும் மையவிலக்கு குழாய்கள், பைப்பட் குறிப்புகள், பைப்பெட்டுகள் போன்றவை அனைத்தும் RNase-இல்லாதவை என்பதை உறுதிப்படுத்தவும்.

அறிவுறுத்தல் கையேடுகள்:

தாவர மொத்த RNA ஐசோலேஷன் கிட் பிளஸ் அறிவுறுத்தல் கையேடு