நாங்கள் அனுபவம் வாய்ந்த உற்பத்தியாளர்.பெரிய தள்ளுபடி சீனாவின் உயர் உணர்திறன் ஒரு-படி ஆய்வு Rt-க்கான அதன் சந்தையின் முக்கியமான சான்றிதழ்களில் பெரும்பான்மையை வென்றது.QpcrKit V2, தரமானது தொழிற்சாலை வாழ்க்கை , வாடிக்கையாளர் தேவையில் கவனம் செலுத்துவதே நிறுவனத்தின் உயிர் மற்றும் வளர்ச்சிக்கான ஆதாரம், நாங்கள் நேர்மை மற்றும் நல்ல நம்பிக்கையுடன் உழைக்கும் மனப்பான்மையைக் கடைப்பிடிக்கிறோம், உங்கள் வரவை எதிர்நோக்குகிறோம்!
நாங்கள் அனுபவம் வாய்ந்த உற்பத்தியாளர்.அதன் சந்தையின் முக்கியமான சான்றிதழ்களில் பெரும்பான்மையை வென்றதுசைனா டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ், Qpcr, எங்கள் நிறுவனம் உறுதியளிக்கிறது: நியாயமான விலைகள், குறுகிய உற்பத்தி நேரம் மற்றும் திருப்திகரமான விற்பனைக்குப் பிந்தைய சேவை, நீங்கள் விரும்பும் எந்த நேரத்திலும் எங்கள் தொழிற்சாலையைப் பார்வையிட உங்களை வரவேற்கிறோம்.இப்போது நாங்கள் ஒன்றாக ஒரு இனிமையான மற்றும் நீண்ட கால வணிகத்தை வைத்திருக்க விரும்புகிறோம்!!!

விளக்கங்கள்

RT-qPCR எதிர்வினைகளுக்கான வளர்ப்பு செல் மாதிரிகளில் இருந்து ஆர்என்ஏவை விரைவாக வெளியிடக்கூடிய தனித்துவமான லிசிஸ் பஃபர் அமைப்பை இந்தக் கருவி பயன்படுத்துகிறது.RNA டெம்ப்ளேட்டை வெறும் 7 நிமிடங்களில் பெறலாம்.கிட் வழங்கிய 5× டைரக்ட் ஆர்டி மிக்ஸ் மற்றும் 2× டைரக்ட் qPCR மிக்ஸ்-SYBR ரியாஜெண்டுகள் நிகழ்நேர அளவு PCR முடிவுகளை விரைவாகவும் திறமையாகவும் பெறலாம்.

5×Direct RT Mix மற்றும் 2×Direct qPCR Mix-SYBR ஆகியவை வலுவான தடுப்பான் சகிப்புத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளன, மேலும் மாதிரிகளின் லைசேட்டை நேரடியாக RT-qPCRக்கான டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தலாம்.இந்தக் கருவியில் தனித்துவமான ஆர்என்ஏ உயர்-தொடர்பு ஃபோர்ஜீன் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் மற்றும் ஹாட் டி-டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ், டிஎன்டிபிகள், எம்ஜிசிஎல் ஆகியவை உள்ளன.₂, எதிர்வினை தாங்கல், PCR உகப்பாக்கி மற்றும் நிலைப்படுத்தி.

விவரக்குறிப்புகள்

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

கிட் கூறுகள்

அம்சங்கள் மற்றும் நன்மைகள்

■ எளிய மற்றும் பயனுள்ள: செல் டைரக்ட் ஆர்டி தொழில்நுட்பம் மூலம், ஆர்என்ஏ மாதிரிகளை வெறும் 7 நிமிடங்களில் பெறலாம்.

■ மாதிரி தேவை சிறியது, 10 செல்கள் வரை சோதனை செய்யலாம்.

■ உயர் செயல்திறன்: இது 384, 96, 24, 12, 6-கிணறு தட்டுகளில் வளர்க்கப்பட்ட செல்களில் ஆர்என்ஏவை விரைவாகக் கண்டறியும்.

■ டிஎன்ஏ அழிப்பான் வெளியிடப்பட்ட மரபணுக்களை விரைவாக நீக்கி, அடுத்தடுத்த சோதனை முடிவுகளில் தாக்கத்தை வெகுவாகக் குறைக்கும்.

■ மேம்படுத்தப்பட்ட RT மற்றும் qPCR அமைப்பு இரண்டு-படி RT-PCR தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனை மிகவும் திறமையானதாகவும், PCR மிகவும் குறிப்பிட்டதாகவும், மேலும் RT-qPCR எதிர்வினை தடுப்பான்களுக்கு அதிக எதிர்ப்புத் திறன் கொண்டதாகவும் ஆக்குகிறது.

கிட் பயன்பாடு

பயன்பாட்டின் நோக்கம்: வளர்ப்பு செல்கள்.

- மாதிரி சிதைவு மூலம் RNA வெளியிடப்பட்டது: இந்தக் கருவியின் RT-qPCR டெம்ப்ளேட்டிற்கு மட்டுமே பொருந்தும்.

- கிட் பின்வரும் நோக்கங்களுக்காகப் பயன்படுத்தப்படலாம்: மரபணு வெளிப்பாடு பகுப்பாய்வு, siRNA-மத்தியஸ்த மரபணு அமைதி விளைவை சரிபார்த்தல், மருந்துப் பரிசோதனை, முதலியன.

வரைபடம்

சேமிப்பு மற்றும் அடுக்கு வாழ்க்கை

இந்த கிட்டின் பகுதி I 4℃ இல் சேமிக்கப்பட வேண்டும்;பகுதி II -20℃ இல் சேமிக்கப்பட வேண்டும்.

Foregene Protease Plus II 4℃ இல் சேமிக்கப்பட வேண்டும், -20℃ இல் உறைய வேண்டாம்.

ரீஜென்ட் 2×Direct qPCR Mix-SYBR இருட்டில் -20℃ இல் சேமிக்கப்பட வேண்டும்;அடிக்கடி பயன்படுத்தினால், குறுகிய கால சேமிப்பிற்காக 4℃ இல் சேமிக்க முடியும் (10 நாட்களுக்குள் பயன்படுத்தவும்). நாங்கள் அனுபவமிக்க உற்பத்தியாளர்.Wining the major in the crucial certifications of its market for Big discounting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, தரமானது தொழிற்சாலை 'வாழ்க்கை , வாடிக்கையாளரின் தேவையில் கவனம் செலுத்துங்கள் நிறுவனத்தின் உயிர் மற்றும் வளர்ச்சியின் ஆதாரம், We adhere to honesty and good faith working attitude, looking forward to your coming !
பெரிய தள்ளுபடிசைனா டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ், Qpcr, எங்கள் நிறுவனம் உறுதியளிக்கிறது: நியாயமான விலைகள், குறுகிய உற்பத்தி நேரம் மற்றும் திருப்திகரமான விற்பனைக்குப் பிந்தைய சேவை, நீங்கள் விரும்பும் எந்த நேரத்திலும் எங்கள் தொழிற்சாலையைப் பார்வையிட உங்களை வரவேற்கிறோம்.இப்போது நாங்கள் ஒன்றாக ஒரு இனிமையான மற்றும் நீண்ட கால வணிகத்தை வைத்திருக்க விரும்புகிறோம்!!!

QuickEஅசிTM Cell Direct RT-qபிசிஆர் Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

செல் நேரடி RT-qPCRக்கு ≤ 1000,000 கலங்களைப் பயன்படுத்துகிறது

தயாரிப்பு அறிமுகம்

இந்த தயாரிப்பு, RT-qPCR எதிர்வினைகளுக்கான வளர்ப்பு செல் மாதிரிகளில் இருந்து RNAவை விரைவாக வெளியிட ஒரு தனித்துவமான லைசிஸ் பஃபர் அமைப்பைப் பயன்படுத்துகிறது, நேரத்தைச் செலவழிக்கும் மற்றும் உழைப்பு மிகுந்த RNA சுத்திகரிப்பு செயல்முறையை நீக்குகிறது, மேலும் தேவையான RNA டெம்ப்ளேட்டைப் பெறுவதற்கு 7 நிமிடங்கள் மட்டுமே, 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR மிக்ஸ்-டக்மான் மூலம் உண்மையான முடிவுகளை விரைவாகப் பெறலாம்.

5× டைரக்ட் ஆர்டி மிக்ஸ் மற்றும் 2× டைரக்ட் க்யூபிசிஆர் மிக்ஸ்-தக்மான் ஆகியவை வலுவான தடுப்பான் சகிப்புத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளன, மேலும் டெம்ப்ளேட்டாக அளவிடப்பட வேண்டிய மாதிரியின் லைசேட்டைப் பயன்படுத்தி திறமையான தலைகீழ் மற்றும் குறிப்பிட்ட பெருக்கத்தைச் செய்ய முடியும்.மறுஉருவாக்கம் ஃபோர்ஜீன் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ், ஹாட் டி-டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ், டிஎன்டிபிகள், எம்ஜிசிஎல் ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது.₂, ரியாக்ஷன் பஃபர், பிசிஆர் ஆப்டிமைசர் மற்றும் ஸ்டெபிலைசர், இது மாதிரிகளை விரைவாகவும் எளிதாகவும் கண்டறிய லிசிஸ் பஃபருடன் பயன்படுத்தப்படலாம், மேலும் அதிக உணர்திறன், தனித்தன்மை மற்றும் நிலைத்தன்மை ஆகியவற்றின் பண்புகளைக் கொண்டுள்ளது.

பொருளின் பண்புகள்

எளிமையான, பயனுள்ள செல் டைரக்ட் ஆர்டி தொழில்நுட்பம் ஆர்என்ஏ மாதிரிகளைப் பெற 7 நிமிடங்களே ஆகும்.

மாதிரி தேவைகள் சிறியவை, மேலும் குறைந்தபட்சம் 10 வளர்ப்பு செல்கள் பரிசோதனைக்கு பயன்படுத்தப்படலாம்.

384, 96, 24, 12, மற்றும் 6-கிணறு தட்டுகள் போன்ற வளர்ப்பு செல்களை விரைவாக ஆர்என்ஏ பெறுவதற்கான உயர் செயல்திறன்.

DNA அழிப்பான் வெளியிடப்பட்ட மரபணுக்களை விரைவாக அகற்ற முடியும், இது அடுத்தடுத்த சோதனை முடிவுகளில் தாக்கத்தை வெகுவாகக் குறைக்கிறது.

மேம்படுத்தப்பட்ட RT மற்றும் qPCR அமைப்புகள் இரண்டு-படி RT-PCR ஐ மிகவும் திறமையான தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன், விவரக்குறிப்பு மற்றும் வலுவான RT-qPCR எதிர்வினை தடுப்பான் சகிப்புத்தன்மையுடன் செயல்படுத்துகின்றன.

கிட் பயன்பாடு

பயன்பாட்டின் நோக்கம்: வளர்ப்பு செல்கள்.

மாதிரி சிதைவு RNA: இரண்டு-படி RT-qPCR டெம்ப்ளேட்டாக மட்டுமே பயன்படுத்தப்படுகிறது.

கிட்கள் பின்வரும் நோக்கங்களுக்காகப் பயன்படுத்தப்படலாம்: மரபணு ஒழுங்குமுறை வெளிப்பாடு பகுப்பாய்வு, அலீல் சோதனை, மருந்துத் திரையிடல் போன்றவை.

கிட் வரம்புகள்

பெருக்கப்பட்ட துண்டுகள் ≤ 300 bp.

செல்களை புதிதாக வளர்ப்பதற்கு கருவிகள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.

தயாரிப்பு தரக் கட்டுப்பாடு

FOREGENE இன் மொத்தத் தர மேலாண்மை அமைப்பின் படி, ஒவ்வொரு தொகுதிக் கருவிகளின் தரத்தின் நம்பகத்தன்மை மற்றும் நிலைத்தன்மையை உறுதி செய்வதற்காக, செல் டைரக்ட் RT-qPCR தொடர் கருவிகளின் ஒவ்வொரு தொகுதியும் பலமுறை கடுமையாக சோதிக்கப்படுகிறது.

கிட் உள்ளடக்கங்கள்

*:செல் லிசிஸ், 5× டைரக்ட் ஆர்டி மிக்ஸ், 2× டைரக்ட் qPCR மிக்ஸ்-தக்மான் தனித்தனியாக வாங்கலாம், விவரங்கள் பின் இணைப்பு 1 (பக்கம் 13) இல் கொடுக்கப்பட்டுள்ளன.

களஞ்சிய நிலைமை

1. கப்பல் நிபந்தனைகள்

கிட் <4 °C நிலையில் இருப்பதை உறுதி செய்வதற்காக, குறைந்த வெப்பநிலை ஐஸ் பேக் பாக்ஸ் போக்குவரத்தின் முழு செயல்முறையும்.

2. சேமிப்பு நிலைமைகள்

பகுதி I 4 ° C மற்றும் பகுதி II -20 ° C இல் சேமிக்கவும்.

Foregene Protease Plus II 4 ° C இல் சேமிக்கப்பட வேண்டும், -20 ° C இல் உறைய வைக்கக்கூடாது.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman -20°C அல்லது 4°C இல் அடிக்கடி பயன்படுத்தினால் (10 நாட்களுக்குள்) குறுகிய கால பயன்பாட்டிற்காக சேமிக்கப்படும்.

கிட் கூறு தகவல்

பஃபர் சிஎல்: செல் சிதைவு எதிர்வினைகளுக்குத் தேவையான சூழலை வழங்குகிறது.

இடையக ST: அடுத்தடுத்த RT இல் விளைவுகளைத் தவிர்க்க லைசேட்டில் செயலில் உள்ள பொருளை நிறுத்துகிறது.

டிஎன்ஏ அழிப்பான்: டிஎன்ஏ நீக்கி, அடுத்தடுத்த சோதனைகளில் மரபணுவை அகற்றுவதன் விளைவு.

5× டைரக்ட் ஆர்டி கலவை: உயர் ஆர்என்ஏ அஃபினிட்டி ஃபோர்ஜீன் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ், ஆர்நேஸ் இன்ஹிபிட்டர், டிஎன்டிபிகள், ஸ்டெபிலைசர்கள், மேம்பாட்டாளர்கள், ஆப்டிமைசர்கள் மற்றும் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ப்ரைமர்கள் ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது (ரேண்டம் ப்ரைமர், ஒலிகோ(டிடி)₁₈ப்ரைமர்).

ஃபோர்ஜீன் புரோட்டீஸ் பிளஸ் II: லிசிஸ் பஃபர் சூழலில், நியூக்ளிக் அமிலங்களை வெளியிட செல்கள் லைஸ் செய்யப்படுகின்றன.

2× நேரடி qPCR மிக்ஸ்-தக்மான்: இந்த மறுஉருவாக்கத்தில் ஹாட் டி-டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ், டிஎன்டிபிகள், எம்ஜிசிஎல் ஆகியவை உள்ளன.₂, எதிர்வினை தாங்கல், PCR உகப்பாக்கி மற்றும் நிலைப்படுத்தி.

20× ROX குறிப்பு சாயம்: பொதுவாக ஏபிஐ, ஸ்ட்ராடஜீன் மற்றும் பிற நிறுவனங்களின் ரியல் டைம் பிசிஆர் பெருக்க கருவிகளில் பயன்படுத்தப்படுகிறது, இது பிசிஆர் டோசிங் பிழைகளால் ஏற்படும் பிசிஆர் குழாய்கள் மற்றும் குழாய்களுக்கு இடையிலான வேறுபாட்டை சரிசெய்யப் பயன்படுகிறது.வெவ்வேறு கருவிகளுக்குத் தேவைப்படும் 20× ROX குறிப்புச் சாயத்தின் செறிவு வேறுபட்டது, மேலும் கருவியின் பரிந்துரைக்கப்பட்ட செறிவுக்கு ஏற்ப பயனர் அதைச் சேர்க்கலாம்.

RNase-இலவச ddH₂O: இரண்டு-படி RT-qPCR எதிர்வினைகளுக்கு RNase இல்லாத ஸ்டெரிலைஸ் செய்யப்பட்ட அல்ட்ரா தூய நீர்.

தற்காப்பு நடவடிக்கைகள்:(கிட் பயன்படுத்துவதற்கு முன் முன்னெச்சரிக்கை நடவடிக்கைகளை கவனமாக படிக்கவும்)

மாதிரிகள் இடையே குறுக்கு-மாசுபாட்டைத் தவிர்க்க, பரிசோதனையின் செயல்பாட்டு முறைக்கு கவனம் செலுத்துங்கள்.

RNase மாசுபாடு மற்றும் RNA சிதைவைத் தவிர்க்க, பரிசோதனை சூழல் மற்றும் பாத்திரங்களின் தூய்மைக்கு கவனம் செலுத்துங்கள்.

புதிய அல்லது நன்கு பாதுகாக்கப்பட்ட செல் மாதிரிகளை எடுத்து, மீண்டும் மீண்டும் உறையவைக்கப்பட்ட செல் மாதிரிகளைப் பயன்படுத்த வேண்டாம்.

5× நேரடி qPCR கலவை,2× நேரடி qPCR கலவை-தக்மான் மீண்டும் மீண்டும் உறைதல்-கரைப்பதைத் தவிர்க்க வேண்டும், இல்லையெனில் அது தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் PCR செயல்திறனை பாதிக்கும்.

தயார்உணவுப்பொருட்கள்முன்அறுவை சிகிச்சை

இந்த கருவியைப் பயன்படுத்துவதற்கு முன், வழிமுறைகளை கவனமாகப் படிக்கவும்.செல் டைரக்ட் RT-qPCR கிட் எளிமையானது, வசதியானது மற்றும் வேகமாக செயல்படக்கூடியது, மேலும் வழிமுறைகள் முழு கிட் மற்றும் அதை எவ்வாறு சரியாகப் பயன்படுத்துவது என்பது பற்றிய முழுமையான தகவலை வழங்குகிறது.பயன்பாட்டிற்கு முன் தேவையான சோதனை பொருட்கள் மற்றும் உபகரணங்களை தயார் செய்யவும்.

பரிசோதனை பொருட்கள் மற்றும் உபகரணங்கள்

◆ கலாச்சார செல்கள்.

◆ 1.5 மில்லி அல்லது 2 மில்லி, RNase-/DNase-இலவச மையவிலக்கு குழாய், RNase-/DNase-இலவச முனை, 0.2 மில்லி மலட்டு qPCR குழாய்.

◆ qPCR இயந்திரம், பைபெட், டேபிள்டாப் மையவிலக்கு (≥13,400×g) (சோதனை தேவைகளைப் பொறுத்து) போன்றவை.

பாதுகாப்பு

◆ இந்த தயாரிப்பு அறிவியல் ஆராய்ச்சி நோக்கங்களுக்காக மட்டுமே, தயவுசெய்து இதை மருந்து, மருத்துவம், உணவு மற்றும் ஒப்பனை நோக்கங்களுக்காக பயன்படுத்த வேண்டாம்.

◆ ரசாயனங்களைப் பயன்படுத்தும் போது, ​​பொருத்தமான ஆய்வக உடைகள், கையுறைகள், பாதுகாப்பு கண்ணாடிகள் போன்றவற்றை அணியுங்கள்.

ஆபரேஷன்வழிகாட்டுகிறது

பின் இணைப்பு 1 (பக்கம் 13) இல் உள்ள விவரங்களுக்கு செல் லிசிஸ் சிஸ்டம்ஸ், ஆர்டி சிஸ்டம்ஸ் மற்றும் qPCR ரியாக்ஷன் தீர்வு துணைப் பொதிகளை தனித்தனியாக வாங்கலாம்.

செயல்பாட்டு வழிகாட்டி

ப: மாதிரி ஆர்என்ஏ வெளியீடு

1.செல்கள் முன்கூட்டியே சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன: செல் வளர்ப்புத் தகட்டை குளிர்ந்த பிபிஎஸ் மூலம் கழுவவும், பின்னர் செல்களை லைஸ் செய்யவும் (10-10⁶), 10⁶ செல்களின் அளவைக் காட்டிலும், ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல் மற்றும் சுத்திகரிப்புக்காக ஃபோர்ஜீன் தி செல் மற்றும் ஆர்என்ஏ ஐசோலேஷன் கிட் மொத்த (டிஇ-03111) அல்லது அனிமல் டோட்டல் ஆர்என்ஏ ஐசோலேஷன் கிட் (டிஇ-03011) பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

1.1ஒட்டிய செல்கள் (24- கிணறு தட்டு உதாரணம்)

1.1.1.ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் உள்ள கலங்களின் எண்ணிக்கையைத் தீர்மானிக்கவும், கலங்களின் எண்ணிக்கை 1 × 10 என்று தீர்மானிக்கவும்⁵, மற்றும் கலாச்சார உணவில் இருந்து கலாச்சார ஊடகத்தை அகற்ற பைப்பெட்டைப் பயன்படுத்தவும்.

1.1.2.ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 200 μl முன் குளிரூட்டப்பட்ட 1 × பிபிஎஸ் சேர்க்கவும்.மீண்டும் மீண்டும் குழாய் பதிக்க வேண்டாம் மற்றும் கிணறுகளில் இருந்து பிபிஎஸ் அகற்றவும்.தட்டை சாய்த்து, முடிந்தவரை PBS ஐ அகற்றவும்.படி 2 க்குச் செல்லவும்.

1.1.3.செல் கலாச்சார உணவில் வெவ்வேறு செல் கலாச்சார உணவு அல்லது குறிப்பு எண் அட்டவணை 1-1 செல் கழுவுவதற்கு முன்கூல் செய்யப்பட்ட 1 × பிபிஎஸ் சேர்க்கப்பட்டது.

அட்டவணை1-1: வெவ்வேறு எண்ணிக்கையிலான கலங்களுக்கான பிபிஎஸ் அளவு

குறிப்பு：உறுதியான ஒட்டிய செல்களை உறுதி செய்ய,கழுவும் போது அதிக எண்ணிக்கையிலான செல் இழப்பு தவிர்க்கப்பட்டது.

1.2சஸ்பென்ஷன் செல்கள் அல்லது ஒட்டிய செல்கள் நுண்துளை இல்லாத தட்டுகளில் வளர்க்கப்படுகின்றன

1.2.1.பல கிணறு அல்லாத தகடுகளில் வளர்க்கப்பட்ட ஒட்டிய செல்கள் (சஸ்பென்ஷன் செல்கள் அடுத்த படி 1.2.2 இலிருந்து தொடங்கும்), சாதாரண செல் சேகரிப்பு முறையின்படி செல்களை சேகரித்து பிரித்து, அவற்றை கலாச்சார தட்டு அல்லது மையவிலக்கு குழாயில் வைக்கவும்;ட்ரிப்சினைசேஷன் பயன்படுத்தப்பட்டால், செல்களைச் சேகரிக்கவும், எஞ்சிய டிரிப்சினை அகற்றவும் மையவிலக்கு தேவைப்படுகிறது, செல்களை சிதறடிப்பதற்காக பிபிஎஸ் மீண்டும் இணைக்கப்பட்ட செல்களை தனிப்பட்ட செல்களில் சேர்த்தது.

1.2.2.எண்ணப்பட்ட கலங்களின் எண்ணிக்கைக்குப் பிறகு, அலிகோட் செய்யப்பட்ட கலங்கள் 1×10⁵ ஒன்று மையவிலக்கு குழாய்கள், 10 நிமிடங்களுக்கு 1000 × g இல் மையவிலக்கு மூலம் செல்களை சேகரிக்கவும்.

1.2.3.மையவிலக்குக் குழாயில் 200 μl பிபிஎஸ் சேர்க்கவும், மீண்டும் மீண்டும் பைப் செய்ய வேண்டாம், மேலும் பிபிஎஸ்ஸை நேரடியாக ஆஸ்பிரேட் செய்யவும்.படி 2 க்குச் செல்லவும். (வீழ்படிவது கடினமாக இருந்தால் மற்றும் செல்கள் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டால், 1000×g மையவிலக்கு செய்யப்பட்ட 10 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு, சூப்பர்நேட்டன்ட்டை நிராகரித்த பிறகு, செல் பெல்லட் படி 2 க்குச் செல்லும்)

2.செல் சிதைவு: பின்வரும் அட்டவணை 1-2 தயாரிக்கப்பட்ட லிசிஸ் அமைப்பின் படி, பஃபர் சிஎல், அதன் வெப்பநிலை அறை வெப்பநிலைக்கு சமன், டிஎன்ஏ அழிப்பான் மற்றும் ஃபோர்ஜீன் புரோட்டீஸ் பிளஸ் II ஆகியவற்றை அகற்றவும்: (லிசிஸ் தீர்வு பயன்படுத்த தயாராக உள்ளது).

அட்டவணை 1-2: பிளவு அமைப்பு தயாரித்தல் (குறிப்பு: பனியில் தயாரிப்பில்)

3.( 24 -கிணறு தட்டு உதாரணம் ) ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 200 μl செல் லிசிஸ் மாஸ்டர் கலந்து, மீண்டும் மீண்டும் 5-10 முறை ஊதவும், அறை வெப்பநிலையில் (20-25 ℃) 5 நிமிடம் அடைகாக்கவும்.

குறிப்பு：குமிழ்கள் உருவாவதைத் தவிர்க்க, 200μl அல்லது அதற்கும் குறைவாக பைப்பெட் அளவு சரிசெய்யப்படும்.சிதைவுக்குப் பிறகு செல்கள் மேகமூட்டமாகத் தோன்றலாம், இது இயல்பானது.

4.(24 –உதாரணமாக கிணறு தட்டு ) திரவ 20 μl பஃபர் ST இல் சேர்க்கப்பட்டது (அட்டவணை 1-3 இல் காட்டப்பட்டுள்ள தொகையில் பல்வேறு சிதைவு அமைப்புகள் சேர்க்கப்பட்டன)

குறிப்பு：பைப்பெட் முனை மேற்பரப்பிற்கு கீழே அகற்றப்பட்டு, லைசேட் சேர்க்கப்படுவதை உறுதி செய்கிறது,குமிழ்கள் உருவாவதைத் தவிர்க்க, 200μl அல்லது அதற்கும் குறைவாக பைப்பெட் அளவை சரிசெய்யும்போது தயவுசெய்து.

அட்டவணை 1-3：இடையக ST ஐச் சேர்க்கவும்

5. லைசேட் அடுத்தடுத்த RT-qPCR சோதனைகளுக்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.அடுத்தடுத்த பரிசோதனைகளை சரியான நேரத்தில் செய்ய முடியாவிட்டால், தயவுசெய்து அதை 2 மணிநேரத்திற்கு மேல் பனியில் வைக்கவும், -20℃ அல்லது -80 ℃ (மூன்று மாதங்களுக்கு மேல்) சேமிக்கவும்.

பி: ஆர்டி அமைப்பு தயாரிப்பு

1. 5 × நேரடி RT கலவையை எடுத்து ஐஸ் பாத் மீது வைக்கவும், அது இயற்கையாக உருகட்டும், பின்னர் பயன்படுத்த மெதுவாக கலக்கவும்RNase-Free ddH2O ஐ எடுத்து அதை உருக்கி, பின்னர் பயன்படுத்த ஒரு ஐஸ் பாத் மீது வைக்கவும்.கீழே உள்ள அட்டவணை 2-1 இன் படி பனியில் எதிர்வினை அமைப்பை தயார் செய்யவும்.

அட்டவணை 2-1: RT எதிர்வினை அமைப்பு தயாரித்தல்

2.சிஸ்டம் ஃபார்முலேஷன் முடிந்த பிறகு, மெதுவாகக் கலந்து, பின்வரும் அட்டவணையில் சுருக்கமாக மையவிலக்கு 2 -2 எதிர்வினை நிலைமைகள் RT எதிர்வினை.

அட்டவணை 2-2: RT எதிர்வினை நிலை அமைப்பு

3. எதிர்வினை முடிந்த பிறகு, எதிர்வினை தயாரிப்பு நேரடியாக qPCR க்காக பனியில் வைக்கப்பட்டது, தயவு செய்து நீண்ட கால பாதுகாப்பு -20℃ அல்லது -80 ℃ .

குறிப்பு: சுத்திகரிக்கப்படாத டெம்ப்ளேட்டைப் பயன்படுத்துவதால், ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் தயாரிப்பில் வெள்ளை படிவுகள் தோன்றக்கூடும்.இது ஒரு சாதாரண நிகழ்வு.அடுத்தடுத்த சோதனைகளுக்கு உடனடியாக சூப்பர்நேட்டன்ட்டை மையவிலக்கு செய்யவும்.

இதன் விளைவாக வரும் RT எதிர்வினை தீர்வு அடுத்த படி ரியல் டைம் PCR எதிர்வினை அமைப்புகளில் சேர்க்கப்படுகிறது, எதிர்வினை அமைப்பின் 10-30% வரையிலான அளவுகளைச் சேர்க்க பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

சி: qPCR எதிர்வினை அமைப்பு தயாரிப்பு

1.ஒரு எதிர்வினை அமைப்பைத் தயாரிப்பதற்கு பின்வரும் அட்டவணை 3-1 இன் படி படி cDNA டெம்ப்ளேட்டில் தயார் செய்யப்பட்ட B இன் பொருத்தமான அளவு.

குறிப்பு: cDNA டெம்ப்ளேட்டின் அளவு qPCR அமைப்பில் 10-30% ஆகும்.எடுத்துக்காட்டாக, 20μl qPCR அமைப்பில், 2-6 μl லிசிஸ் பஃப்பரைச் சேர்க்கவும், ஆனால் 6 μlக்கு மேல் இல்லை.

2. qPCR எதிர்வினைக்கான தேர்வுமுறை நல்ல qPCR நிலைமைகள் (அனீலிங் வெப்பநிலை ， போன்றவை) (அட்டவணை 3-2 இல் கொடுக்கப்பட்ட எதிர்வினை நிலைமைகள்).

குறிப்பு: சிறந்த முடிவுகளைப் பெற qPCR எதிர்வினைகளுக்கு உகந்த நிலைமைகளைப் பயன்படுத்த முயற்சிக்கவும்.

அட்டவணை 3-1: PCR எதிர்வினை அமைப்பு தயாரித்தல்

1*: ப்ரைமர் எதிர்வினை செயல்திறன் மோசமாக இருக்கும் போது ப்ரைமர் செறிவை 50-900 nM வரம்பில் சரிசெய்யலாம்.

குறிப்பு: qPCR அமைப்பை பரிசோதனை தேவைகள் மற்றும் ஃப்ளோரசன்ஸ் சைக்கிள் மாதிரிக்கு ஏற்ப சரிசெய்யலாம்.50 இல் qPCR க்குμl அமைப்பு, 20 க்கு ஏற்ப ரியாஜெண்ட் அளவை விகிதாசாரமாக சரிசெய்யவும்μl அமைப்பு.

2*: ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவு வெப்ப சுழற்சியின் படி ROX குறிப்பு சாயத்தின் பொருத்தமான இறுதி செறிவைத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.பொதுவான ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவு சுழற்சிகளுக்கான மிகவும் பொருத்தமான ROX குறிப்பு சாய செறிவுகள் கீழே உள்ள அட்டவணையில் காட்டப்பட்டுள்ளன:

அட்டவணை 3-2: qPCR எதிர்வினை நிலைமைகள் வழங்கப்பட்டுள்ளன

குறிப்பு: சிறந்த qPCR விளைவைப் பெற, கிரேடியன்ட் PCR ஆனது வெவ்வேறு வார்ப்புருக்கள் மற்றும் வெவ்வேறு ப்ரைமர்களுக்கான எதிர்வினை நிலைமைகளை மேம்படுத்த பயன்படுத்தப்படலாம்.ஃப்ளோரசன்ஸ் பகுப்பாய்வி, டெம்ப்ளேட், ப்ரைமர் போன்றவற்றைப் பொறுத்து PCR எதிர்வினை நிலைகள் மாறுபடும். குறிப்பிட்ட செயல்பாட்டில், ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவு வெப்ப சுழற்சியின் குறிப்பிட்ட நிபந்தனைகள், டெம்ப்ளேட் வகை, ஆர்வத்தின் அளவு, பெருக்கப்பட்ட துண்டுகளின் அடிப்படை வரிசை மற்றும் GC வினையின் உள்ளடக்கம் மற்றும் நீளம், வெப்பநிலை, ப்ரைமர்களின் நேரம், உள்ளடக்கம் மற்றும் நீளம் போன்றவை.

ரியல் டைம் பிசிஆர் ப்ரைமர் வடிவமைப்பு கொள்கைகள்

ஃபார்வர்ட் ப்ரைமர் மற்றும் ரிவர்ஸ் ப்ரைமர்

ரியல் டைம் பிசிஆருக்கு, ப்ரைமர் வடிவமைப்பு மிகவும் முக்கியமானது.ப்ரைமர்கள் PCR பெருக்கத்தின் தனித்தன்மை மற்றும் செயல்திறனுடன் தொடர்புடையவை, மேலும் பின்வரும் கொள்கைகளைக் கொண்டு வடிவமைக்க முடியும்:

◆ ப்ரைமர் நீளம்: 18-30bp.

◆ GC உள்ளடக்கம்: 40-60%.

◆ Tm மதிப்பு: ப்ரைமர் 5 போன்ற ப்ரைமர் வடிவமைப்பு மென்பொருள், ப்ரைமரின் Tm மதிப்பைக் கொடுக்கலாம்.அப்ஸ்ட்ரீம் மற்றும் கீழ்நிலை ப்ரைமர்களின் Tm மதிப்புகள் முடிந்தவரை நெருக்கமாக இருக்க வேண்டும்.Tm கணக்கீடு சூத்திரத்தையும் பயன்படுத்தலாம்: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).PCR ஐச் செய்யும்போது, ​​5 °C இன் ப்ரைமர் Tm மதிப்புக்குக் கீழே உள்ள வெப்பநிலை பொதுவாக அனீலிங் வெப்பநிலையாகத் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகிறது (அதனுடன் இணைந்த வெப்பநிலை அதிகரிப்பு PCR எதிர்வினையின் தனித்தன்மையை அதிகரிக்கும்).

◆ ப்ரைமர்கள் மற்றும் PCR தயாரிப்புகள்:

◆ டிசைன் ப்ரைமர் PCR பெருக்க தயாரிப்பு நீளம் 100-150bp ஆக இருக்க வேண்டும்.

◆ டெம்ப்ளேட்டின் இரண்டாம் கட்டமைப்பு பகுதியில் வடிவமைப்பு ப்ரைமர்கள் முடிந்தவரை தவிர்க்கப்பட வேண்டும்.

◆ அப்ஸ்ட்ரீம் மற்றும் டவுன்ஸ்ட்ரீம் ப்ரைமர்களின் 3′ முனைகளுக்கு இடையே 2 அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட நிரப்பு தளங்கள் உருவாகுவதைத் தவிர்க்கவும்.

◆ ப்ரைமர் 3′ டெர்மினல் பேஸ் 3 கூடுதல் தொடர்ச்சியான G அல்லது C உடன் இருக்க முடியாது.

◆ ப்ரைமர்கள் தாங்களே நிரப்பு கட்டமைப்புகளைக் கொண்டிருக்க முடியாது, இல்லையெனில் ஒரு ஹேர்பின் அமைப்பு உருவாகும், இது PCR பெருக்கத்தை பாதிக்கும்.

◆ ATCG ப்ரைமர் வரிசையில் முடிந்தவரை சமமாக விநியோகிக்கப்பட வேண்டும், மேலும் 3′ டெர்மினல் பேஸ் T ஆக தவிர்க்கப்பட வேண்டும்.

பின் இணைப்பு1：Cஎல் டைரக்ட்RT-qPCR கிட் கலவைடி சப்ளிமெண்ட் பேக்

1.செல் லிசிஸ் தீர்வு