பைப்பெட் டிப்ஸ் மற்றும் இபி டியூப்கள் போன்றவற்றின் ஸ்டெரிலைசேஷன்.

1. டீயோனைஸ் செய்யப்பட்ட தண்ணீருடன் 0.1% (ஆயிரத்தில் ஒரு பங்கு) DEPC (அதிக நச்சுப் பொருள்) தயார் செய்து, அதை ஒரு ஃப்யூம் ஹூட்டில் கவனமாகப் பயன்படுத்தவும், மேலும் 4 டிகிரி செல்சியஸ் வெளிச்சத்தில் இருந்து அதை சேமிக்கவும்;

DEPC நீர் என்பது DEPC உடன் சுத்திகரிக்கப்பட்ட தூய நீர் மற்றும் அதிக வெப்பநிலை மற்றும் உயர் அழுத்தத்தால் கிருமி நீக்கம் செய்யப்படுகிறது.RNase, DNase மற்றும் புரோட்டினேஸ் இல்லாததா என சோதிக்கப்பட்டது.

2. குழாய் முனை மற்றும் EP குழாயை 0.1% DEPC இல் வைத்து, குழாய் முனை மற்றும் EP குழாயில் 0.1% DEP நிரப்பப்பட்டிருப்பதை உறுதி செய்யவும்.

3. ஒளியிலிருந்து பாதுகாக்கவும், நிற்கவும், ஒரே இரவில் (12-24 மணிநேரம்)

4. முனை மற்றும் EP குழாய் கொண்ட பெட்டியை DEPC இல் ஊற வைக்க தேவையில்லை.முனை அல்லது EP குழாயில் உள்ள DEPC தண்ணீரை தோராயமாக அகற்றிய பிறகு, அதை பேக் அப் செய்து போர்த்தி வைக்கவும்.

5. 121 டிகிரி செல்சியஸ், 30நிமி

6. 180 டிகிரி செல்சியஸ், பல மணிநேரங்களுக்கு உலர்த்தவும் (குறைந்தது 3 மணிநேரம்)

குறிப்பு: ஏ.DEPC ஐ கையாளும் போது லேடெக்ஸ் கையுறைகள் மற்றும் முகமூடிகளை அணியுங்கள்!b, அல்லது DEPC கருத்தடை இல்லாமல், 130 ℃, 90min ஆட்டோகிளேவ் (பல ஆய்வகங்கள் இரண்டு முறை உயர் வெப்பநிலை கருத்தடை)

ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல் பரிசீலனைகள்

திசு ஆர்என்ஏ தனிமைப்படுத்தல் தோல்வியின் இரண்டு முக்கிய நிகழ்வுகள்

ஆர்என்ஏ சிதைவு மற்றும் திசுக்களில் உள்ள அசுத்தங்களின் எச்சங்கள்,சிதைவு பற்றி, வளர்ப்பு உயிரணுக்களிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏ ஏன் எளிதில் சிதைவதில்லை என்பதை முதலில் பார்ப்போம்.தற்போதுள்ள RNA பிரித்தெடுத்தல் வினைகள் அனைத்தும் RNase ஐ விரைவாகத் தடுக்கும் கூறுகளைக் கொண்டிருக்கின்றன.வளர்ப்பு உயிரணுக்களில் லைசேட்டைச் சேர்த்து, அதை வெறுமனே கலக்கவும், அனைத்து செல்களும் லைசேட்டுடன் முழுமையாக கலக்கப்படலாம், மேலும் செல்கள் முற்றிலும் லைஸ் செய்யப்படுகின்றன.செல்கள் லைஸ் செய்யப்பட்ட பிறகு, லைசேட்டில் உள்ள செயலில் உள்ள பொருட்கள் உடனடியாக உள்செல்லுலார் RNase ஐத் தடுக்கின்றன, எனவே RNA அப்படியே இருக்கும்.அதாவது, வளர்க்கப்பட்ட செல்கள் லைசேட்டுடன் எளிதாகவும் முழுமையாகவும் தொடர்பு கொள்வதால், அவற்றின் ஆர்என்ஏ எளிதில் சிதைவடையாது;மறுபுறம், திசுக்களில் உள்ள செல்கள் லைசேட்டை விரைவாகத் தொடர்புகொள்வது எளிதல்ல என்பதால் திசுக்களில் உள்ள ஆர்என்ஏ எளிதில் சிதைந்துவிடும்.போதுமான தொடர்பு காரணமாக.அதனால்,ஆர்.என்.ஏ செயல்பாட்டைத் தடுக்கும் அதே வேளையில் திசுவை ஒரு கலமாக மாற்றுவதற்கு ஒரு வழி இருப்பதாகக் கருதினால், சிதைவின் சிக்கலை முழுமையாக தீர்க்க முடியும்.

திரவ நைட்ரஜன் அரைப்பது மிகவும் பயனுள்ள முறையாகும்.இருப்பினும், திரவ நைட்ரஜன் அரைக்கும் முறை மிகவும் தொந்தரவாக இருக்கிறது, குறிப்பாக மாதிரிகளின் எண்ணிக்கை அதிகமாக இருக்கும்போது.இது அடுத்த சிறந்த விஷயத்திற்கு வழிவகுத்தது: ஹோமோஜெனைசர்.திஒருமைப்படுத்திசெல்கள் லைசேட்டுடன் தொடர்புகொள்வதற்கு முன்பு RNase செயல்பாடு எவ்வாறு தடுக்கப்படுகிறது என்ற கேள்வியை முறை கருத்தில் கொள்ளவில்லை, மாறாக திசு சீர்குலைவு விகிதம் உள்செல்லுலார் RNase ஐ சிதைக்கும் விகிதத்தை விட வேகமாக இருக்க வேண்டும் என்று பிரார்த்தனை செய்கிறது.

எலக்ட்ரிக் ஹோமோஜெனிசரின் விளைவு சிறந்தது,மற்றும் கண்ணாடி ஹோமோஜெனிசரின் விளைவு மோசமாக உள்ளது, ஆனால் பொதுவாக, ஹோமோஜெனிசர் முறையால் சீரழிவு நிகழ்வைத் தடுக்க முடியாது.எனவே, பிரித்தெடுத்தல் சிதைந்தால், அசல் எலக்ட்ரிக் ஹோமோஜெனிசரை திரவ நைட்ரஜனுடன் அரைக்கப் பயன்படுத்த வேண்டும்;அசல் கண்ணாடி ஹோமோஜெனிசரை ஒரு எலக்ட்ரிக் ஹோமோஜெனிசராக மாற்ற வேண்டும் அல்லது நேரடியாக திரவ நைட்ரஜனுடன் அரைக்க வேண்டும்.பிரச்சனை கிட்டத்தட்ட 100% சாத்தியமானது.தீர்வு கிடைக்கும்.

அசுத்த எச்ச பிரச்சனை, அடுத்தடுத்த சோதனைகளை பாதிக்கும், சிதைவை விட பல்வேறு காரணங்களைக் கொண்டுள்ளது, மேலும் தீர்வுகளும் அதற்கேற்ப வேறுபட்டவை.முடிவில்,திசுக்களில் சிதைவு அல்லது எஞ்சிய அசுத்தங்கள் இருந்தால், குறிப்பிட்ட சோதனைப் பொருளுக்கான பிரித்தெடுக்கும் முறை/உருவாக்கம் உகந்ததாக இருக்க வேண்டும்.உங்களின் விலைமதிப்பற்ற மாதிரிகளை மேம்படுத்துவதற்கு நீங்கள் பயன்படுத்த வேண்டியதில்லை: நீங்கள் சந்தையில் இருந்து மீன்/கோழி போன்ற சில சிறிய விலங்குகளை வாங்கலாம், ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுக்கும் பொருளின் தொடர்புடைய பகுதியை எடுத்துக் கொள்ளலாம், மேலும் புரதத்தை பிரித்தெடுக்க மற்றொரு பகுதியை வாய், வயிறு மற்றும் குடல் சாற்றில் அரைக்கலாம்.

பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏவின் இலக்கு ஆர்என்ஏ பல்வேறு பின்தொடர்தல் சோதனைகளுக்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் அதன் தரத் தேவைகள் வேறுபட்டவை

cDNA நூலக கட்டுமானத்திற்கு என்சைம் எதிர்வினை தடுப்பான்களின் எச்சங்கள் இல்லாமல் RNA ஒருமைப்பாடு தேவைப்படுகிறது;வடக்குக்கு அதிக ஆர்என்ஏ ஒருமைப்பாடு மற்றும் என்சைம் எதிர்வினை தடுப்பான்களின் எச்சங்களுக்கான குறைந்த தேவைகள் தேவை;RT-PCRக்கு அதிக ஆர்என்ஏ ஒருமைப்பாடு தேவையில்லை,ஆனால் என்சைம் எதிர்வினைகளைத் தடுக்கிறது.எச்ச தேவைகள் கடுமையானவை.உள்ளீடு வெளியீட்டைத் தீர்மானிக்கிறது;ஒவ்வொரு முறையும் மிக உயர்ந்த தூய்மையான ஆர்என்ஏவைப் பெறுவதே இலக்காக இருக்கும் போது, ​​அது மக்களுக்கும் பணத்துக்கும் செலவாகும்.

மாதிரிகள் சேகரிப்பு/சேமிப்பு

சீரழிவை பாதிக்கும் காரணிகள் மாதிரி உயிருள்ள உடலை/அல்லது அசல் வளர்ச்சி சூழலை விட்டு வெளியேறிய பிறகு, மாதிரியில் உள்ள எண்டோஜெனஸ் என்சைம்கள் ஆர்என்ஏவை சிதைக்க ஆரம்பிக்கும்,மற்றும் சிதைவு விகிதம் எண்டோஜெனஸ் என்சைம்கள் மற்றும் வெப்பநிலையின் உள்ளடக்கத்துடன் தொடர்புடையது.பாரம்பரியமாக, எண்டோஜெனஸ் என்சைம் செயல்பாட்டை முற்றிலுமாகத் தடுக்க இரண்டு வழிகள் மட்டுமே உள்ளன: உடனடியாக லைசேட்டைச் சேர்த்து, முழுமையாகவும் விரைவாகவும் ஒரே மாதிரியாக மாற்றவும்;சிறிய துண்டுகளாக வெட்டி உடனடியாக திரவ நைட்ரஜனில் உறைய வைக்கவும்.இரண்டு அணுகுமுறைகளுக்கும் விரைவான செயல்பாடு தேவைப்படுகிறது.பிந்தையது அனைத்து மாதிரிகளுக்கும் ஏற்றது, அதே சமயம் முந்தையது குறைந்த செல்கள் மற்றும் எண்டோஜெனஸ் என்சைம்கள் மற்றும் ஒரே மாதிரியாக எளிதாக இருக்கும் திசுக்களுக்கு மட்டுமே பொருத்தமானது.குறிப்பாக, தாவர திசு, கல்லீரல், தைமஸ், கணையம், மண்ணீரல், மூளை, கொழுப்பு, தசை திசு போன்றவை தொடரும் முன் திரவ நைட்ரஜனுடன் சிறந்த முறையில் உறைந்திருக்கும்.

மாதிரிகள் துண்டு துண்டாக மற்றும் ஒருமைப்படுத்தல்

சிதைவு மற்றும் மகசூல் மாதிரி துண்டு துண்டாக பாதிக்கும் காரணிகள்முழுமையான ஒத்திசைவுக்காக, இது RNA இன் முழுமையான மற்றும் முழுமையான வெளியீட்டிற்கானது.செல்களை உடைக்காமல் நேரடியாக ஒரே மாதிரியாக மாற்றலாம்.உடைந்த பின்னரே திசுக்களை ஒரே மாதிரியாக மாற்ற முடியும்.ஈஸ்ட் மற்றும் பாக்டீரியாவை ஒரே மாதிரியாக மாற்றுவதற்கு முன், தொடர்புடைய நொதிகளுடன் உடைக்க வேண்டும்.குறைந்த எண்டோஜெனஸ் என்சைம் உள்ளடக்கம் மற்றும் எளிதான ஒரே மாதிரியான தன்மை கொண்ட திசுக்கள் ஒரு ஹோமோஜெனிசரால் லைசேட்டில் ஒரே நேரத்தில் நசுக்கப்பட்டு ஒரே மாதிரியாக மாற்றப்படலாம்;தாவர திசு, கல்லீரல், தைமஸ், கணையம், மண்ணீரல், மூளை, கொழுப்பு, தசை திசு மற்றும் பிற மாதிரிகள், அவை எண்டோஜெனஸ் என்சைம்களில் அதிகமாக உள்ளன அல்லது எளிதில் ஒரே மாதிரியாக இல்லை,எனவே திசு சீர்குலைவு மற்றும் ஒருமைப்படுத்தல் தனித்தனியாக செய்யப்பட வேண்டும்.துண்டு துண்டாக மிகவும் நம்பகமான மற்றும் அதிக உற்பத்தி முறை திரவ நைட்ரஜனுடன் அரைப்பது ஆகும், மேலும் ஒருமைப்படுத்தலின் மிகவும் நம்பகமான முறை ஒரு மின்சார ஒத்திசைவைப் பயன்படுத்துவதாகும்.திரவ நைட்ரஜனுடன் அரைப்பது பற்றிய ஒரு சிறப்பு குறிப்பு: முழு அரைக்கும் செயல்முறையின் போது மாதிரியை கரைக்கக்கூடாது, ஏனெனில் உறைந்திருக்கும் போது எண்டோஜெனஸ் என்சைம்கள் செயல்பட அதிக வாய்ப்புள்ளது.

லைசேட்டின் தேர்வு

செயல்பாட்டின் வசதி மற்றும் எஞ்சிய உள்ளுறுப்பு அசுத்தங்களின் காரணிகளைப் பாதிக்கிறது பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் லிசிஸ் தீர்வுகள் RNase இன் செயல்பாட்டை கிட்டத்தட்ட தடுக்கலாம்.எனவே, ஒரு லிசிஸ் தீர்வைத் தேர்ந்தெடுப்பதற்கான முக்கிய அம்சம், சுத்திகரிப்பு முறையுடன் இணைந்து கருத்தில் கொள்ள வேண்டும்.ஒரு விதிவிலக்கு உள்ளது:அதிக எண்டோஜெனஸ் என்சைம் உள்ளடக்கம் கொண்ட மாதிரிகள், எண்டோஜெனஸ் என்சைம்களை செயலிழக்கச் செய்யும் திறனை அதிகரிக்க பீனால் கொண்ட லைசேட்டைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

சுத்திகரிப்பு முறையின் தேர்வு

எஞ்சிய உள்ளுறுப்பு அசுத்தங்களைப் பாதிக்கும் காரணிகள், பிரித்தெடுக்கும் வேகம் செல்கள் போன்ற சுத்தமான மாதிரிகளுக்கு, கிட்டத்தட்ட எந்த சுத்திகரிப்பு முறையிலும் திருப்திகரமான முடிவுகளைப் பெறலாம்.ஆனால் பல மாதிரிகளுக்கு, குறிப்பாக தாவரங்கள், கல்லீரல், பாக்டீரியா போன்ற அதிக அளவு அசுத்தங்கள் உள்ளவை, பொருத்தமான சுத்திகரிப்பு முறையைத் தேர்ந்தெடுப்பது முக்கியம்.நெடுவரிசை மையவிலக்கு சுத்திகரிப்பு முறையானது வேகமான பிரித்தெடுத்தல் வேகத்தைக் கொண்டுள்ளது மற்றும் ஆர்என்ஏவின் அடுத்தடுத்த நொதி வினையை பாதிக்கும் அசுத்தங்களை திறம்பட நீக்க முடியும், ஆனால் இது விலை உயர்ந்தது (ஃபோர்ஜீன் செலவு குறைந்த கருவிகளை வழங்க முடியும், மேலும் விவரங்கள் கிளிக் செய்யவும்.இங்கே);LiCl மழைப்பொழிவு போன்ற பொருளாதார மற்றும் உன்னதமான சுத்திகரிப்பு முறைகளைப் பயன்படுத்தி, திருப்திகரமான முடிவுகளைப் பெறலாம், ஆனால் செயல்பாட்டு நேரம் நீண்டது..

ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுப்புக்கான "மூன்று துறைகள் மற்றும் எட்டு கவனம்"

ஒழுக்கம் 1:வெளிப்புற நொதிகளின் மாசுபாட்டிற்கு முற்றுப்புள்ளி வைக்கவும்.

குறிப்பு 1:முகமூடிகள் மற்றும் கையுறைகளை கண்டிப்பாக அணியுங்கள்.

குறிப்பு 2:சோதனையில் ஈடுபட்டுள்ள மையவிலக்கு குழாய்கள், முனைத் தலைகள், பைப்பெட் கம்பிகள், எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் தொட்டிகள் மற்றும் சோதனை பெஞ்சுகள் ஆகியவை முழுமையாக அப்புறப்படுத்தப்பட வேண்டும்.

குறிப்பு 3:பரிசோதனையில் ஈடுபட்டுள்ள எதிர்வினைகள்/தீர்வுகள், குறிப்பாக நீர், RNase-இல்லாததாக இருக்க வேண்டும்.

ஒழுக்கம் 2:எண்டோஜெனஸ் என்சைம்களின் செயல்பாட்டைத் தடுக்கவும்

குறிப்பு 4:பொருத்தமான ஒத்திசைவு முறையைத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.

குறிப்பு 5:பொருத்தமான லைசேட்டைத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.

குறிப்பு 6:மாதிரியின் தொடக்க அளவைக் கட்டுப்படுத்தவும்.

ஒழுக்கம் 3:உங்கள் பிரித்தெடுத்தல் நோக்கத்தை தெளிவுபடுத்துங்கள்

குறிப்பு 7:எந்த லைசேட் அமைப்பும் மாதிரியின் அதிகபட்ச தொடக்க அளவை நெருங்கும் போது, ​​பிரித்தெடுத்தல் வெற்றி விகிதம் கடுமையாக குறைகிறது.

குறிப்பு 8:வெற்றிகரமான ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுப்பதற்கான ஒரே பொருளாதார அளவுகோல் அடுத்தடுத்த சோதனைகளில் வெற்றியாகும், விளைச்சல் அல்ல.

RNase மாசுபாட்டின் முதல் 10 ஆதாரங்கள்

1. வெளிப்புற நொதிகளின் முதல் ஆதாரமாக விரல்கள் உள்ளன, எனவே கையுறைகளை அடிக்கடி அணிய வேண்டும் மற்றும் மாற்ற வேண்டும்.கூடுதலாக, முகமூடிகளையும் அணிய வேண்டும், ஏனென்றால் சுவாசமும் நொதிகளின் முக்கிய ஆதாரமாகும்.கையுறை முகமூடியை அணிவதன் கூடுதல் நன்மை பரிசோதனையாளரைப் பாதுகாப்பதாகும்.

2. குழாய் முனைகள், மையவிலக்கு குழாய்கள், குழாய்கள் - RNase ஐ ஸ்டெரிலைசேஷன் மூலம் மட்டும் செயலிழக்கச் செய்ய முடியாது, எனவே குழாய் முனைகள் மற்றும் மையவிலக்கு குழாய்கள் DEPC சிகிச்சை எனக் குறிக்கப்பட்டிருந்தாலும், DEPC உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட வேண்டும்.ஒரு சிறப்பு நோக்கத்திற்காக பைப்பெட்டைப் பயன்படுத்துவது சிறந்தது, பயன்படுத்துவதற்கு முன் 75% ஆல்கஹால் பருத்தி பந்துடன் துடைக்கவும், குறிப்பாக கம்பி;கூடுதலாக, ஹெட் ரிமூவரைப் பயன்படுத்த வேண்டாம்.

3. நீர்/தடுப்பு RNase மாசு இல்லாமல் இருக்க வேண்டும்.

4. குறைந்தபட்சம் சோதனை அட்டவணையை 75% ஆல்கஹால் பருத்தி பந்துகளால் துடைக்க வேண்டும்.

5.எண்டோஜெனஸ் RNase அனைத்து திசுக்களிலும் எண்டோஜெனஸ் என்சைம்கள் உள்ளன, எனவே திரவ நைட்ரஜனுடன் திசுக்களை விரைவாக உறைய வைப்பது சிதைவைக் குறைக்க சிறந்த வழியாகும்.திரவ நைட்ரஜன் சேமிப்பு/அரைக்கும் முறை உண்மையில் சிரமமாக உள்ளது, ஆனால் அதிக அளவு எண்டோஜெனஸ் என்சைம்களைக் கொண்ட திசுக்களுக்கு இது ஒரே வழி.

6. ஆர்.என்.ஏ மாதிரிகள் ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுக்கும் பொருட்களில் ஆர்.நேஸ் மாசுபாட்டின் தடயங்கள் இருக்கலாம்.

7. பிளாஸ்மிட் பிரித்தெடுத்தல் பிளாஸ்மிட் பிரித்தெடுத்தல் பெரும்பாலும் ஆர்என்ஏவை சிதைக்க Rnase ஐப் பயன்படுத்துகிறது, மேலும் மீதமுள்ள Rnase புரோட்டினேஸ் K உடன் செரிக்கப்பட வேண்டும் மற்றும் PCI ஆல் பிரித்தெடுக்கப்பட வேண்டும்.

8. RNA சேமிப்பு குறைந்த வெப்பநிலையில் சேமிக்கப்பட்டாலும், RNase இன் சுவடு அளவுகள் RNA சிதைவை ஏற்படுத்தும்.ஆர்.என்.ஏ.வின் நீண்ட காலப் பாதுகாப்பிற்கான சிறந்த தீர்வு உப்பு/ஆல்கஹால் இடைநீக்கம் ஆகும், ஏனெனில் ஆல்கஹால் குறைந்த வெப்பநிலையில் அனைத்து நொதி செயல்பாடுகளையும் தடுக்கிறது.

9. கேஷன்ஸ் (Ca, Mg) இந்த அயனிகளைக் கொண்டிருக்கும் போது, ​​80C இல் 5 நிமிடங்களுக்கு வெப்பமடைவதால் RNA பிளவுபடும், எனவே RNA சூடாக்கப்பட வேண்டும் என்றால், பாதுகாப்பு கரைசலில் ஒரு செலேட்டிங் ஏஜென்ட் (1mM சோடியம் சிட்ரேட், pH 6.4) இருக்க வேண்டும்.

10. அடுத்தடுத்த சோதனைகளில் பயன்படுத்தப்படும் என்சைம்கள் RNase மூலம் மாசுபடுத்தப்படலாம்.

ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுப்பதற்கான 10 குறிப்புகள்

1: RNase செயல்பாட்டை விரைவாகத் தடுக்கவும்.சேகரிக்கப்பட்ட பிறகு மாதிரிகள் விரைவாக உறைந்துவிடும், மேலும் சிதைவின் போது விரைவான செயல்பாட்டின் மூலம் RNase செயலிழக்கப்படுகிறது.

2: அதிக ரைபோசைம் உள்ளடக்கம் கொண்ட திசுக்களுக்கு பொருத்தமான பிரித்தெடுக்கும் முறையைத் தேர்வு செய்யவும், மேலும் கொழுப்பு திசு பீனால் கொண்ட முறையைப் பயன்படுத்துவது சிறந்தது.

3: கணிப்புத் தரத்திற்கு வடக்குத் தேவை, cDNA நூலகக் கட்டுமானத்திற்கு அதிக ஒருமைப்பாடு தேவை, மேலும் RT-PCR மற்றும் RPA (Ribonuclease protection assay) க்கு அதிக ஒருமைப்பாடு தேவையில்லை.RT-PCRக்கு அதிக தூய்மை தேவைப்படுகிறது (என்சைம் இன்ஹிபிட்டர் எச்சங்கள்).

4: விளைச்சலை மேம்படுத்துவதற்கும் சீரழிவைக் குறைப்பதற்கும் முழுமையான ஒருமைப்படுத்தல் முக்கியமானது.

5: ஆர்என்ஏ எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் கண்டறிதலின் ஒருமைப்பாட்டை சரிபார்க்கவும், 28S: 18S = 2: 1 ஒரு முழுமையான அறிகுறியாகும், 1: 1 என்பது பெரும்பாலான சோதனைகளுக்கு ஏற்கத்தக்கது.

6: RT-PCR க்கான டிஎன்ஏவை அகற்றுதல், வரிசை பகுப்பாய்வு டிஎன்ஏவை அகற்ற Dnase I ஐப் பயன்படுத்துவது சிறந்தது.

7: வெளிப்புற நொதிகளின் மாசுபாட்டைக் குறைக்கவும் - என்சைம்களை வெளியில் இருந்து இறக்குமதி செய்ய முடியாது.

8: குறைந்த செறிவு கொண்ட நியூக்ளிக் அமிலத்தை செறிவூட்டும் போது, ​​ஒரு இணை-வீழ்ச்சி ரீஜென்ட் சேர்க்கப்பட வேண்டும்.ஆனால் என்சைம்கள் மற்றும் டிஎன்ஏ மாசுபாட்டைக் கொண்ட இணை-வீழ்ச்சியைத் தடுக்க.

9: ஆர்என்ஏவை நன்கு கரைக்கவும், தேவைப்பட்டால், 65C க்கு 5 நிமிடங்களுக்கு சூடாக்கவும்.

பொருத்தமான சேமிப்பு முறை

இது குறுகிய காலத்திற்கு –20C மற்றும் நீண்ட காலத்திற்கு –80C இல் சேமிக்கப்படும்.ஆர்என்ஏ விளைச்சலை மேம்படுத்துவதற்கான முதல் படி, வெவ்வேறு மாதிரிகளின் ஆர்என்ஏ உள்ளடக்கம் பெரிதும் மாறுபடுகிறது என்பதை உணர வேண்டும்.கல்லீரல், கணையம், இதயம், மூளை, கரு, சிறுநீரகம், நுரையீரல், தைமஸ், கருப்பை, குறைந்த மிகுதி (<0.05ug/mg) mg) போன்ற கல்லீரல், கணையம், இதயம், நடுத்தர அளவு (0.05-2ug/mg) போன்ற அதிக அளவு (2-4ug/mg) சிறுநீர்ப்பை, எலும்பு, கொழுப்பு.

1: RN ஐ வெளியிட லைஸ் செல்கள் - RNA வெளியிடப்படவில்லை என்றால், மகசூல் குறையும்.எலக்ட்ரிக் ஹோமோஜெனிசேஷன் மற்ற ஹோமோஜெனிசேஷன் முறைகளை விட சிறப்பாக செயல்படுகிறது, ஆனால் திரவ நைட்ரஜன் பிசைதல், நொதி செரிமானம் (லைசோசைம்/லைடிகேஸ்) போன்ற பிற முறைகளுடன் இணைக்க வேண்டியிருக்கலாம்.

2: பிரித்தெடுக்கும் முறையை மேம்படுத்துதல்.ஃபீனால் அடிப்படையிலான முறைகளின் மிகப்பெரிய பிரச்சனைகள் முழுமையற்ற அடுக்கு மற்றும் பகுதியளவு ஆர்என்ஏ இழப்பு (மேலதிசையை முழுமையாக அகற்ற முடியாது).முழுமையற்ற அடுக்குகள் அதிக நியூக்ளிக் அமிலம் மற்றும் புரத உள்ளடக்கம் காரணமாகும், இது பயன்படுத்தப்படும் லைசேட்டின் அளவை அதிகரிப்பதன் மூலம் அல்லது மாதிரியின் அளவைக் குறைப்பதன் மூலம் தீர்க்கப்படலாம்.குளோரோஃபார்ம் பிரித்தெடுத்தலின் ஒரு படி கொழுப்பு திசுக்களில் சேர்க்கப்பட்டது.ஆர்என்ஏ இழப்பை பின்-பம்ப் செய்வதன் மூலம் அல்லது கரிம அடுக்கை அகற்றுவதன் மூலம் மையவிலக்கு மூலம் குறைக்கலாம்.நெடுவரிசை மையவிலக்கு-அடிப்படையிலான முறைகளின் மிகப்பெரிய பிரச்சனை அதிகப்படியான மாதிரி ஆகும்.

கிளாசிக் பிரித்தெடுத்தல் குறிப்புகள்

1. பீனால் சுத்திகரிப்பு: சம அளவு 1:1 பீனால்/குளோரோஃபார்ம் சேர்த்து 1-2 நிமிடங்களுக்கு தீவிரமாக கலக்கவும்.2 நிமிடங்களுக்கு அதிவேகத்தில் மையவிலக்கு.சூப்பர்நேட்டண்ட் (80-90%) கவனமாக அகற்றவும்.நடுத்தர அடுக்குக்கு ஒருபோதும் செல்ல வேண்டாம்.எதிர்வினைக் கரைசலின் சம அளவு பினோல்/குளோரோஃபார்மில் சேர்க்கப்பட்டு, சூப்பர்நேட்டன்ட் அகற்றப்படும்.விளைச்சலை மேம்படுத்த நியூக்ளிக் அமில மழைப்பொழிவுக்கு இரண்டு சூப்பர்நேட்டண்டுகளையும் ஒன்றாகக் கலக்கலாம்.கலக்கும்போது மிகவும் மென்மையாக இருக்காதீர்கள், மேலும் அனைத்து சூப்பர்நேட்டன்ட்களையும் அகற்ற முயற்சிக்காதீர்கள்.

2. 70-80% எத்தனால் கொண்டு கழுவுதல்: சலவை செய்யும் போது, ​​எஞ்சியிருக்கும் உப்பு கழுவப்படுவதை உறுதிசெய்ய, நியூக்ளிக் அமிலம் இடைநிறுத்தப்பட வேண்டும்.அதே நேரத்தில், எத்தனாலை ஊற்றிய உடனேயே, சில வினாடிகளுக்கு அதிவேகத்தில் மையவிலக்கு செய்து, பின்னர் ஒரு பைப்பட் மூலம் மீதமுள்ள எத்தனாலை அகற்றவும்.அறை வெப்பநிலையில் 5-10 நிமிடங்கள் நின்ற பிறகு கரைக்கவும்.

11. சிறப்பு அமைப்புகளின் பிரித்தெடுத்தல்

1. நார்ச்சத்து திசு: இதயம்/எலும்பு தசை போன்ற நார் திசுக்களில் இருந்து ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுப்பதற்கான திறவுகோல் திசுவை முற்றிலும் சீர்குலைப்பதாகும்.இந்த திசுக்கள் குறைந்த செல் அடர்த்தியைக் கொண்டிருக்கின்றன, எனவே திசுக்களின் ஒரு யூனிட் எடைக்கு ஆர்.என்.ஏ அளவு குறைவாக உள்ளது, மேலும் முடிந்தவரை தொடக்கத் தொகையைப் பயன்படுத்துவது நல்லது.உறைபனி நிலையில் திசுவை நன்கு அரைக்க வேண்டும்.

2. அதிக புரதம்/கொழுப்பு உள்ள திசுக்கள்: மூளை/காய்கறி கொழுப்புச் சத்து அதிகம்.பிசிஐ பிரித்தெடுத்த பிறகு, சூப்பர்நேட்டண்டில் வெள்ளை ஃப்ளோக்குல்கள் உள்ளன.சூப்பர்நேட்டண்ட் குளோரோஃபார்ம் மூலம் மீண்டும் பிரித்தெடுக்கப்பட வேண்டும்.

3. அதிக நியூக்ளிக் அமிலம்/ரைபோசைம் உள்ளடக்கம் கொண்ட திசுக்கள்: மண்ணீரல்/தைமஸில் அதிக நியூக்ளிக் அமிலம் மற்றும் ரைபோசைம் உள்ளடக்கம் உள்ளது.உறைபனி நிலைமைகளின் கீழ் திசுவை அரைப்பது, அதைத் தொடர்ந்து விரைவான ஒத்திசைவு ரைபோசைம்களை திறம்பட செயலிழக்கச் செய்யும்.இருப்பினும், லைசேட் மிகவும் பிசுபிசுப்பாக இருந்தால் (அதிக நியூக்ளிக் அமில உள்ளடக்கம் காரணமாக), பிசிஐ பிரித்தெடுத்தல் திறம்பட அடுக்கி வைக்க முடியாது;மேலும் லைசேட் சேர்ப்பதன் மூலம் இந்த சிக்கலை தீர்க்க முடியும்.பல பிசிஐ பிரித்தெடுத்தல் அதிக எஞ்சிய டிஎன்ஏவை அகற்றும்.ஆல்கஹாலைச் சேர்த்த உடனேயே வெள்ளை நிற படிவு ஏற்பட்டால், அது டிஎன்ஏ மாசுபாட்டைக் குறிக்கிறது.கரைந்த பிறகு அமில PCI உடன் மீண்டும் பிரித்தெடுத்தல் DNA மாசுபாட்டை அகற்றும்.

4. தாவர திசு: விலங்கு திசுக்களை விட தாவர திசு மிகவும் சிக்கலானது.பொதுவாக, தாவரங்கள் திரவ நைட்ரஜன் நிலைமைகளின் கீழ் தரையில் உள்ளன, எனவே எண்டோஜெனஸ் என்சைம்களால் ஆர்என்ஏ சிதைவு அசாதாரணமானது.சிதைவு பிரச்சனை தீர்க்கப்படாவிட்டால், அது மாதிரியில் உள்ள அசுத்தங்களால் நிச்சயமாக ஏற்படுகிறது.பல தாவரங்களில் உள்ள அசுத்தங்கள் எச்சங்களுக்கு வழிவகுக்கும், மேலும் இந்த அசுத்தங்கள் ஆர்.என்.ஏவுடன் சில ஒற்றுமைகள் இருப்பதால் பெரும்பாலும் எச்சங்கள் ஏற்படுகின்றன: நீங்கள் படியும் மற்றும் நான் படியும், நீங்கள் உறிஞ்சும் மற்றும் நான் உறிஞ்சும்.இந்த பண்புகள் அவை மிகவும் வலுவான என்சைம் தடுப்பான்கள் என்பதை தீர்மானிக்கின்றன.

தற்போது, ​​வணிக ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல் உதிரிபாகங்கள் சிறிய மாற்றங்களுடன் கிட்டத்தட்ட அனைத்து விலங்கு திசுக்களுக்கும் மாற்றியமைக்கப்படலாம், ஆனால் பெரும்பாலான தாவர திசுக்களுக்கு பொருத்தமான வணிகரீதியான ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல் எதிர்வினைகள் குறைவாகவே உள்ளன.அதிர்ஷ்டவசமாக, Foregene சிறப்பு வழங்க முடியும்ஆலை ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுக்கும் கருவிகள், எங்களிடம் உள்ளதுதாவர மொத்த RNA ஐசோலேஷன் கிட், தாவர மொத்த RNA ஐசோலேஷன் கிட் பிளஸ்.பிந்தையது அதிக பாலிசாக்கரைடு மற்றும் பாலிபினால் உள்ளடக்கம் கொண்ட தாவரங்களுக்காக சிறப்பாக வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது.ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தலுக்கு, ஆய்வகப் பயனர்களின் கருத்து சிறப்பாக உள்ளது.

12. மாதிரி உறைதல் மற்றும் உருகுவதன் விளைவு உறைந்த மாதிரி பெரியதாக இருக்கலாம், மேலும் ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுப்பதற்கு பயன்படுத்தப்படுவதற்கு முன்பு அதை வெட்ட வேண்டும்.வெட்டும் போது மாதிரிகள் உருகும் (ஒருவேளை ஓரளவு).உறைந்த மாதிரிகள் ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுப்பதற்கு முன் எடைபோட வேண்டியிருக்கும், மேலும் இந்தச் செயல்பாட்டின் போது கரைதல் கண்டிப்பாக ஏற்படும்.சில நேரங்களில், திரவ நைட்ரஜன் அரைக்கும் செயல்பாட்டின் போது மாதிரியின் உருகுவதும் ஏற்படுகிறது;அல்லது உறைந்த மாதிரி திரவ நைட்ரஜன் துருவல் இல்லாமல் நேரடியாக லைசேட்டில் சேர்க்கப்படுகிறது, மேலும் முழுமையான ஒத்திசைவுக்கு முன் கரைதல் கண்டிப்பாக ஏற்படும்.புதிய திசுவை விட உறைந்த திசு உருகும்போது ஆர்.என்.ஏ சிதைவுக்கு அதிக வாய்ப்புள்ளது என்று சோதனைகள் காட்டுகின்றன.சாத்தியமான காரணம்: உறைதல்-கரை செயல்முறை செல்லுக்குள் உள்ள கட்டமைப்புகளை சீர்குலைத்து, எண்டோஜெனஸ் என்சைம்கள் RNA உடன் நேரடி தொடர்புக்கு வருவதை எளிதாக்குகிறது.

13. ஆர்என்ஏ தரத்தின் தீர்ப்பு பொதுவாக, ஆர்என்ஏவின் ஒருமைப்பாட்டை மதிப்பிடுவதற்கு எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் பயன்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் ஆர்என்ஏவின் தூய்மையை தீர்மானிக்க ஏ260/ஏ280 பயன்படுத்தப்படுகிறது.கோட்பாட்டில், அப்படியே RNA 28S:18S = 2.7:1 என்ற விகிதத்தைக் கொண்டுள்ளது, மேலும் பெரும்பாலான தரவுகள் 28S:18S = 2:1 என்ற விகிதத்தை வலியுறுத்துகின்றன.உண்மை என்னவென்றால், செல்களைத் தவிர மற்ற மாதிரிகளிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏ எதுவும் 2:1 விகிதத்தில் இல்லை (இது அஜிலன்ட் பயோஅனாலைசரைப் பயன்படுத்தி பெறப்பட்டது).

ஆர்என்ஏவின் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் முடிவுகள், இரண்டாம் நிலை அமைப்பு, எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் நிலைகள், மாதிரி சுமை, ஈபியால் செறிவூட்டப்பட்ட அளவு, முதலிய பல காரணிகளால் பாதிக்கப்படுகிறது.2kb இல் 28S மற்றும் 0.9kb இல் 18S தெளிவாகவும், 28S: 18S > 1 ஆகவும் இருந்தால், ஒருமைப்பாடு பெரும்பாலான அடுத்தடுத்த சோதனைகளின் தேவைகளைப் பூர்த்தி செய்யும்.

A260/A280 என்பது பல குழப்பங்களை ஏற்படுத்திய குறிகாட்டியாகும்.முதலில், நியூக்ளிக் அமிலங்களுக்கான இந்த குறிகாட்டியின் அசல் அர்த்தத்தை தெளிவுபடுத்துவது அவசியம்: தூய RNA, அதன் A260/280 = சுமார் 2.0.தூய RNA 'காரணம்' மற்றும் A260/A280 = 2 'விளைவு' ஆகும்.இப்போது அனைவரும் A260/A280 ஐ 'காரணமாக' பயன்படுத்துகிறார்கள், "A260/A280 = 2 என்றால், ஆர்என்ஏ தூய்மையானது" என்று நினைக்கிறார்கள், இது இயற்கையாகவே குழப்பத்திற்கு வழிவகுக்கிறது.

நீங்கள் ஆர்வமாக இருந்தால், பினோல், குவானிடைன் ஐசோதியோசயனேட், PEG போன்றவற்றை பிரித்தெடுப்பதில் அடிக்கடி பயன்படுத்தப்படும் ஒரு சிறிய வினைபொருளை உங்கள் RNA மாதிரியில் சேர்த்து, பின்னர் A260/A280 விகிதத்தை அளவிடலாம்.உண்மை என்னவென்றால், ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுப்பதற்குப் பயன்படுத்தப்படும் பல உதிரிபாகங்களும், மாதிரியில் உள்ள பல அசுத்தங்களும், A260/A280 ஐப் பாதிக்கும், A260 மற்றும் A280 ஐ உறிஞ்சுகின்றன.

200-300 nm வரம்பில் RNA மாதிரிகளை ஸ்கேன் செய்வதே தற்போது மிகவும் அறிவுறுத்தும் அணுகுமுறையாகும்.தூய RNAவின் வளைவு பின்வரும் பண்புகளைக் கொண்டுள்ளது: வளைவு மென்மையானது, A230 மற்றும் A260 இரண்டு ஊடுருவல் புள்ளிகள், A300 0க்கு அருகில் உள்ளது, A260/A280 = 2.0, மற்றும் A260/A230 = 2.0.ஸ்கேன் தரவு கிடைக்கவில்லை என்றால், A260/A230 விகிதமும் தீர்மானிக்கப்பட வேண்டும், ஏனெனில் இந்த விகிதம் நொதி எதிர்வினையை பாதிக்கும் அனைத்து அசுத்தங்களையும் எடுத்துச் செல்வதற்கு அதிக உணர்திறன் கொண்டது.சாதனத்தின் நேரியல் வரம்பை கணக்கில் எடுத்துக் கொள்ளுங்கள் (A260க்கு 0.1–0.5).

இரண்டு பயனுள்ள நிகழ்வுகள் உள்ளன: A260/A280 தண்ணீரில் அளவிடப்படும் போது விகிதம் 0.3 குறைவாக இருக்கும்;10 mM EDTA இல் அளவிடப்பட்ட விகிதம் 1 mM EDTA இல் அளவிடப்பட்டதை விட 0.2 அதிகமாக உள்ளது.

தொடர்புடைய தயாரிப்புகள்:

சீனா ஆலை மொத்த RNA ஐசோலேஷன் கிட் உற்பத்தியாளர் மற்றும் சப்ளையர் |Foregene (foreivd.com)

ஆர்என்ஏ தனிமைப்படுத்தல் தொடர் சப்ளையர்கள் மற்றும் தொழிற்சாலை |சீனா ஆர்என்ஏ தனிமைப்படுத்தல் தொடர் உற்பத்தியாளர்கள் (foreivd.com)

ஆர்என்ஏ தனிமைப்படுத்தல் தொடர் - ஃபோர்ஜீன் கோ., லிமிடெட் (foreivd.com)