RT-qPCR பரிசோதனையில் RNA பிரித்தெடுத்தல் மற்றும் தர மதிப்பீடு, தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் qPCR மூன்று படிகள் உள்ளன, ஒவ்வொரு படியிலும் நிறைய முன்னெச்சரிக்கைகள் உள்ளன, நாங்கள் கீழே விரிவாக அறிமுகப்படுத்துவோம்.

Ⅰஆர்என்ஏ தர மதிப்பீடு

RT-qPCR பரிசோதனையில், ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல் முடிந்த பிறகு, ஆர்என்ஏவின் தரம் மதிப்பீடு செய்யப்பட வேண்டும், அது தகுதியான பிறகுதான் பின்தொடர் பரிசோதனையை மேற்கொள்ள முடியும்.மதிப்பீட்டு முறைகளில் ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டர், அஜிலன்ட் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ், அஜிலன்ட் 2100 பகுப்பாய்வு ஆகியவை அடங்கும், அவற்றில் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டர் மற்றும் அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் முறை கண்டறிதல்.RNA செறிவு, தூய்மை மற்றும் ஒருமைப்பாடு ஆகியவற்றின் கண்டறிதல் மற்றும் பகுப்பாய்வை முடிக்க இந்த இரண்டு முறைகளும் ஒன்றாகப் பயன்படுத்தப்பட வேண்டும் என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும்.

தொடர்புடைய ஆர்என்ஏ ஐசோலேஷன் கிட்: 

செல் மொத்த RNA ஐசோலேஷன் கிட்

மிகவும் சுத்திகரிக்கப்பட்ட மற்றும் உயர்தர மொத்த ஆர்என்ஏவை 11 நிமிடங்களில் பல்வேறு வளர்ப்பு செல்களில் இருந்து பெறலாம்.

விலங்கு மொத்த ஆர்என்ஏ தனிமைப்படுத்தல் கிட்

பல்வேறு விலங்கு திசுக்களில் இருந்து உயர் தூய்மை மற்றும் உயர்தர மொத்த ஆர்என்ஏவை விரைவாகவும் திறமையாகவும் பிரித்தெடுக்கவும்.

ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டர்:

ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டர் முக்கியமாக ஆர்என்ஏவின் செறிவு மற்றும் தூய்மையைத் தீர்மானிக்கப் பயன்படுகிறது, ஆனால் அது ஆர்என்ஏ மற்றும் மரபணு எச்சத்தின் ஒருமைப்பாட்டைக் கண்டறிய முடியாது.அவற்றில், A260/280 மற்றும் A260/230 ஆகியவை RNA தூய்மையைக் கண்டறிவதற்கான முக்கியமான அளவுருக்கள் ஆகும், மேலும் அவற்றின் மதிப்புகளின் ஏற்ற இறக்கத்தைப் பொறுத்து RNA தூய்மையைக் கண்டறியலாம்:

1. 1.9< A260/280< 2.1, RNA தூய்மை நல்லது என்பதைக் குறிக்கிறது;A260/280<1.9, ஆர்என்ஏவில் புரத எச்சம் இருக்கலாம் என்பதைக் குறிக்கிறது;A260/280>2.1, ஆர்என்ஏவின் சாத்தியமான பகுதி சிதைவைக் குறிக்கிறது, இது அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் மேலும் உறுதிப்படுத்தப்படலாம்.

2. 2.0< A260/230< 2.2, RNA தூய்மை நல்லது என்பதைக் குறிக்கிறது;A260/230< 2.0, ஆர்என்ஏவில் பீனால்கள், எத்தனால் அல்லது சர்க்கரைகள் போன்ற கரிம வினைப்பொருட்களின் எச்சங்கள் இருக்கலாம் என்பதைக் குறிக்கிறது.

அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ்:

அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மதிப்பீடு ஆர்என்ஏ ஒருமைப்பாடு, மரபணு மற்றும் புரத எச்சங்களை பகுப்பாய்வு செய்யலாம், ஆனால் ஆர்என்ஏவின் செறிவை துல்லியமாக கணக்கிட முடியாது அல்லது கரிம வினைப்பொருட்களின் எச்சங்களை கண்டறிய முடியாது.உதாரணமாக யூகாரியோடிக் ஆர்என்ஏ வார்ப்புருக்களை எடுத்துக் கொள்ளுங்கள்:

1. ஆர்என்ஏ அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸுக்கு உட்படுத்தப்பட்டது.ஜெல் வரைபடத்தில் 28sRNA, 18sRNA மற்றும் 5.8sRNA ஆகிய மூன்று ஒற்றை பட்டைகள் மட்டுமே இருந்தால், பிரித்தெடுக்கப்பட்ட RNA அப்படியே இருப்பதைக் குறிக்கிறது.இழுக்கும் நிகழ்வு இருந்தால், அது ஆர்.என்.ஏ.வின் பகுதியளவு சிதைவைக் குறிக்கிறது.

2. பசை துளைக்கும் 28sRNA பட்டைக்கும் இடையே ஒரு பிரகாசமான பட்டை இருந்தால், மரபணு DNA எச்சம் இருக்கலாம்.

3. பசை துளையில் பட்டைகள் தோன்றினால், புரதம் மற்றும் பிற மேக்ரோமாலிகுலர் பொருட்களின் எச்சங்கள் இருக்கலாம் என்பதைக் குறிக்கிறது.

Ⅱ. தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன்

ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுத்தல் முடிந்ததும், அடுத்தடுத்த சோதனைகளுக்கு சிடிஎன்ஏவாக மாற்றப்பட வேண்டும், எனவே தலைகீழ் படிநிலை அவசியம்.தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் மற்றும் ப்ரைமரின் தேர்விலிருந்து தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் அறிமுகப்படுத்தப்படும்:

தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் தேர்வு:

வழக்கமான தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ்களில் AMV RTase மற்றும் MMLV RTase ஆகியவை அடங்கும்.AMV RTase இன் RNase H வலுவான செயல்பாடு, குறுகிய தொகுப்பு நீளம், குறைந்த தொகுப்பு அளவு மற்றும் நல்ல வெப்ப நிலைத்தன்மை (42 ~ 55℃) ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது.MMLV RTase இன் RNase H செயல்பாடு பலவீனமானது, தொகுப்பு நீளம் நீளமானது, தொகுப்பு அளவு அதிகமாக உள்ளது மற்றும் வெப்ப நிலைத்தன்மை மோசமாக உள்ளது (37 ~ 42℃).

RNase H என்சைம் ஆர்என்ஏ டெம்ப்ளேட்டைச் சிதைக்கும் செயல்பாட்டைக் கொண்டிருப்பதால், பலவீனமான RNase H செயல்பாட்டைக் கொண்ட MMLV ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் போது முன்னுரிமையாகத் தேர்ந்தெடுக்கப்பட வேண்டும், பின்னர் மரபணுப் பொறியியலுக்குப் பிறகு, MMLV இன் வெப்ப நிலைத்தன்மை ஒரு தரமான பாய்ச்சலை எட்டியுள்ளது.Foregene எடுத்துக்கொள்வதுஃபோரேஸி ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ்(தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கான எம்-எம்எல்வி) எடுத்துக்காட்டாக, இது மரபணு மறுசீரமைப்பு தொழில்நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தி ஈ.கோலி பொறிக்கப்பட்ட பாக்டீரியாவில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட ஒரு புதிய தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் ஆகும்.இது ஒரு மறுசீரமைப்பு டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் ஆகும், இது ஒற்றை இழையான ஆர்என்ஏ, டிஎன்ஏ அல்லது ஆர்என்ஏ:டிஎன்ஏ கலப்பினத்திலிருந்து ஒரு நிரப்பு டிஎன்ஏ இழையை ஒருங்கிணைக்கிறது.இது RNase H செயல்பாடு, வலுவான நிலைப்புத்தன்மை, வலுவான RNA தொடர்பு மற்றும் உயர் கண்டறிதல் உணர்திறன் ஆகியவற்றைக் கொண்டிருக்கவில்லை.

 

ஃபோரேஸி ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ்(தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கான எம்-எம்எல்வி)

ப்ரைமர் தேர்வு:

பொதுவாக ஆர்டி ப்ரைமர்கள் மூன்று வகைகளாகப் பிரிக்கப்படுகின்றன: ஒலிகோ டிடி, ரேண்டம் ப்ரைமர்கள் மற்றும் மரபணு-குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள்.வெவ்வேறு சோதனைத் தேவைகளுக்கு ஏற்ப பயன்படுத்த பொருத்தமான ப்ரைமர்களைத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.

1. டெம்ப்ளேட் யூகாரியோடிக் தோற்றம் மற்றும் தாமதமான cDNA வழக்கமான PCR பெருக்கத்திற்கு பயன்படுத்தப்பட்டால், Oligo (dT) பரிந்துரைக்கப்படுகிறது;அடுத்தடுத்த சோதனை qPCR க்கு மட்டுமே பயன்படுத்தப்பட்டால், தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் செயல்திறனை மேம்படுத்த ஒலிகோ (dT) ரேண்டம் ப்ரைமர்களுடன் கலக்க பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

2. வார்ப்புரு ப்ரோகாரியோட்களில் இருந்து இருந்தால், ரேண்டம் ப்ரைமர்கள் அல்லது மரபணு குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கு தேர்ந்தெடுக்கப்பட வேண்டும்.

Ⅲ.qPCR

ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவீடு முக்கியமாக அளவு முறைகள், ப்ரைமர் வடிவமைப்பு கொள்கைகள், ROX தேர்வு, எதிர்வினை அமைப்பு உள்ளமைவு மற்றும் எதிர்வினை நிலைமைகள் அமைப்பு போன்றவற்றின் தேர்வு ஆகியவற்றிலிருந்து விரிவாக விவரிக்கப்படுகிறது.

அளவு முறைகளின் தேர்வு:

அளவு முறைகள் உறவினர் அளவு முறைகள் மற்றும் முழுமையான அளவு முறைகள் என பிரிக்கப்படுகின்றன.மரபணு வெளிப்பாட்டின் சில சிகிச்சை முறைகளின் விளைவைக் கண்டறிய, வெவ்வேறு நேரங்களில் மரபணு வெளிப்பாட்டின் வேறுபாட்டைக் கண்டறிய மற்றும் வெவ்வேறு திசுக்களில் உள்ள மரபணு வெளிப்பாட்டின் வேறுபாட்டை ஒப்பிடுவதற்கு உறவினர் அளவீடு பயன்படுத்தப்படலாம்.முழுமையான அளவீடு மூலம் வைரஸ் மற்றும் பலவற்றில் உள்ள நியூக்ளிக் அமிலத்தின் அளவைக் கண்டறிய முடியும்.பரிசோதனைகளைச் செய்யும்போது, ​​நம்முடைய சொந்தச் சோதனைகளின்படி பொருத்தமான அளவு முறைகளைத் தேர்ந்தெடுக்க வேண்டும்.

முதன்மை வடிவமைப்பு கொள்கைகள்:

qPCR க்கான ப்ரைமரின் வடிவமைப்பு நேரடியாக பெருக்க செயல்திறன் மற்றும் தயாரிப்பு விவரக்குறிப்புடன் தொடர்புடையது.எனவே, நல்ல ப்ரைமர்களை சரியாக வடிவமைப்பது வெற்றிகரமான qPCR இன் முதல் படியாகும்.ப்ரைமரின் வடிவமைப்பில், வழக்கமான ப்ரைமர் வடிவமைப்பின் கொள்கையை பூர்த்தி செய்யும் போது பின்வரும் கொள்கைகளுக்கு கவனம் செலுத்தப்பட வேண்டும்:

1. இலக்கு துண்டின் நீளம் 100 மற்றும் 300 bp இடையே கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது;

2. மரபணு டிஎன்ஏவின் செல்வாக்கைத் தவிர்க்க கிராஸ்-எக்ஸான் வடிவமைப்பு;

3. வடிவமைக்கப்பட்ட ப்ரைமர்கள் பெருக்க செயல்திறனுக்காக சோதிக்கப்பட வேண்டும், மேலும் பெருக்க திறன் தரநிலையை (90-110%) அடையும் போது மட்டுமே அவை அளவு சோதனைகளுக்கு பயன்படுத்தப்படலாம்;

4. ப்ரைமர் செறிவு பொதுவாக 0.1uM மற்றும் 1.0uM இடையே உகந்ததாக இருக்கும்.

தேர்வுROX:

அளவு வினையின் செயல்பாட்டில், ROX ஆனது ஆப்டிகல் பாதை வேறுபாடு, குழாய்ப் பிழை அல்லது ஆவியாதல் மற்றும் ஒடுக்கம் ஆகியவற்றால் ஏற்படும் தொகுதி வேறுபாட்டை ஒரே சீராக சரிசெய்து, முடிவுகளின் மறுநிகழ்வை மேம்படுத்துகிறது.இருப்பினும், ROX இன் தேர்வு கருவியுடன் தொடர்புடையது என்பதை கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும்.qPCR கருவியானது துளைகளுக்கு இடையே உள்ள வேறுபாட்டை தானாக சரிசெய்யும் செயல்பாட்டைக் கொண்டிருந்தால், அதற்கு ROX ஐ சேர்க்க வேண்டிய அவசியமில்லை;இல்லையெனில், அது ROX திருத்தத்தைச் சேர்க்க வேண்டும்.ரியாஜெண்டுகளை வாங்குவதில் சிறிய பங்குதாரர்கள் சரியான ROX ஐ தேர்வு செய்ய பயன்படுத்தப்படும் கருவியின் படி இருக்க வேண்டும், பின்னர் தவறுகளை தவிர்க்கவும்.

எதிர்வினை அமைப்பு தயாரித்தல்:

20ul மற்றும் 50ul இன் எதிர்வினை அளவுகள் விரும்பப்படுகின்றன.கணினியை உருவாக்கும்போது பின்வரும் விஷயங்களுக்கு கவனம் செலுத்தப்பட வேண்டும்:

1. அல்ட்ரா-க்ளீன் வொர்க்பெஞ்சில் காற்றோட்டம் மூலம் எதிர்வினை அமைப்பு தயாரிக்கப்பட வேண்டும், புதிய ddH₂ஒவ்வொரு பரிசோதனைக்கும் O பயன்படுத்தப்படுகிறது;

2. ஒவ்வொரு பரிசோதனையும் கணினியில் மாசு உள்ளதா என்பதைச் சரிபார்க்க என்டிசியைத் தயாரிக்க வேண்டும், மேலும் சிஸ்டத்தைத் தயாரிக்கும் போது ஒவ்வொரு ஜோடி ப்ரைமர்களும் என்டிசியைச் செய்ய வேண்டும்;

3. RNA டெம்ப்ளேட்டில் gDNA எச்சம் உள்ளதா என்பதைக் கண்டறிய, ஒவ்வொரு மாதிரியையும் கண்டறிவதற்காக NRT தயார் செய்யலாம்;

4. அமைப்பைத் தயாரிக்கும் போது, ​​ஒரு மாதிரிக்கு குறைந்தபட்சம் 3 தொழில்நுட்ப மறுபடியும் செய்ய பரிந்துரைக்கப்படுகிறது;

5. டெம்ப்ளேட் cDNA ஆக இருக்கும் போது, ​​qPCR பரிசோதனையில் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் அமைப்பின் தடுப்பு விளைவைக் குறைக்க 5-10 முறை நீர்த்துப்போக பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.சாய்வு மூலம் டெம்ப்ளேட் அளவை ஆராய்வது நல்லது, இதனால் CT மதிப்பு 20-30 க்கு இடையில் குறைகிறது;

6. எதிர்வினைகளின் தேவையான எண்ணிக்கையைத் தீர்மானிக்கவும், எதிர்வினைகளின் எண்ணிக்கையின் அடிப்படையில் 5-10% அதிகரிக்கவும், தொகுதி கட்டமைப்பு எண்ணைக் கணக்கிடவும்;

7, மையவிலக்குக்குப் பிறகு கலந்து, குமிழ்கள் வராமல் பார்த்துக் கொள்ள, பிரிமிக்ஸ் கொள்கையைப் பயன்படுத்தி கணினி தயாரிக்கப்படுகிறது;

8, முடிந்தவரை துணை நுகர்பொருட்களைத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.

தொடர்புடைய RT-qPCR கிட்