ப்ரைமர் வடிவமைப்பு அடிப்படையில் (99% சிக்கல்களை தீர்க்க முடியும்)
1. ப்ரைமர் நீளம்: பாடப்புத்தகத்திற்கு 15-30bp தேவைப்படுகிறது, பொதுவாக சுமார் 20bp.தனித்தன்மையை உறுதிப்படுத்த உண்மையான நிலை 18-24bp ஆக இருப்பது நல்லது, ஆனால் நீண்ட நேரம் சிறப்பாக, மிக நீண்ட ப்ரைமர் குறிப்பிட்ட தன்மையைக் குறைத்து, விளைச்சலைக் குறைக்கும்.
2. ப்ரைமர் பெருக்க இடைவெளி: 200-500bp பொருத்தமானது, மேலும் குறிப்பிட்ட நிபந்தனைகளின் கீழ் துண்டு 10kb வரை விரிவாக்கப்படலாம்.
3. ப்ரைமர் பேஸ்: G+C இன் உள்ளடக்கம் 40-60% ஆக இருக்க வேண்டும், மிகக் குறைவான G+C பெருக்க விளைவு நல்லதல்ல, G+C அதிகமாக இருந்தால் குறிப்பிடப்படாத பட்டைகள் தோன்றுவது எளிது.5 க்கும் மேற்பட்ட ப்யூரின் அல்லது பைரிமிடின் நியூக்ளியோடைடுகளின் தொகுப்புகளைத் தவிர்த்து, ATGC சீரற்ற முறையில் சிறப்பாக விநியோகிக்கப்படுகிறது.நிலைத்தன்மையை அதிகரிக்க 5′ முடிவுக்கான மல்டி-ஜிசி மற்றும் இடைநிலை வரிசைகள், 3′ முடிவில் ரிச் ஜிசியை தவிர்க்கவும், கடைசி 3 பேஸ்களுக்கு ஜிசி இல்லை அல்லது கடைசி 5 பேஸ்களில் 3க்கு ஜிசி இல்லை.
4. ப்ரைமர்களில் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பைத் தவிர்க்கவும், இரண்டு ப்ரைமர்களுக்கு இடையே நிரப்புதலைத் தவிர்க்கவும், குறிப்பாக 3 'இறுதியில் நிரப்புதல், இல்லையெனில் ப்ரைமர் டைமர் உருவாகும் மற்றும் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கப்பட்ட பட்டைகள் உருவாக்கப்படும்.
5. ப்ரைமர்களின் 3 'இறுதியில் உள்ள தளங்கள், குறிப்பாக கடைசி மற்றும் இறுதித் தளங்கள், இணைக்கப்படாத டெர்மினல் பேஸ்கள் காரணமாக PCR தோல்வியைத் தவிர்க்க கண்டிப்பாக இணைக்கப்பட வேண்டும்.
6. ப்ரைமர்கள் பொருத்தமான பிளவு தளங்களைக் கொண்டிருக்கின்றன அல்லது சேர்க்கப்படலாம், மேலும் பெருக்கப்பட்ட இலக்கு வரிசையானது பொருத்தமான பிளவு தளங்களைக் கொண்டிருக்க வேண்டும், இது பிளவு பகுப்பாய்வு அல்லது மூலக்கூறு குளோனிங்கிற்கு மிகவும் பயனுள்ளதாக இருக்கும்.
7. ப்ரைமர்களின் தனித்தன்மை: நியூக்ளிக் அமில வரிசை தரவுத்தளத்தில் உள்ள பிற வரிசைகளுடன் ப்ரைமர்களுக்கு வெளிப்படையான ஹோமோலஜி இருக்கக்கூடாது.
8. மென்பொருளைப் பயன்படுத்த கற்றுக்கொள்ளுங்கள்: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (இந்த ஆன்லைன் வடிவமைப்பு சிறப்பாக செயல்படுகிறது).
மேலே உள்ள உள்ளடக்கம் குறைந்தபட்சம் 99% முதன்மை வடிவமைப்பு சிக்கல்களைத் தீர்க்கும்.
ப்ரைமர் வடிவமைப்பின் விவரங்களைக் கட்டுப்படுத்தவும்
1. ப்ரைமர் நீளம்
பொது ப்ரைமர் நீளம் 18-30 தளங்கள்.பொதுவாக, ப்ரைமரின் அனீலிங் வெப்பநிலையை நிர்ணயிக்கும் மிக முக்கியமான காரணி ப்ரைமரின் நீளம் ஆகும்.ப்ரைமரின் அனீலிங் வெப்பநிலை பொதுவாக தேர்ந்தெடுக்கப்படுகிறது (Tm மதிப்பு -5℃), மேலும் சிலர் Tm மதிப்பை நேரடியாகப் பயன்படுத்துகின்றனர்.ப்ரைமர்களின் அனீலிங் வெப்பநிலையை தோராயமாக கணக்கிட பின்வரும் சூத்திரங்கள் பயன்படுத்தப்படலாம்.
ப்ரைமரின் நீளம் 20bp க்கும் குறைவாக இருக்கும்போது: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
ப்ரைமரின் நீளம் 20bp ஐ விட அதிகமாக இருக்கும் போது: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/நீளம்-5℃
கூடுதலாக, அனீலிங் வெப்பநிலையைக் கணக்கிட பல மென்பொருள்களும் பயன்படுத்தப்படலாம், கணக்கீட்டுக் கொள்கை வேறுபட்டதாக இருக்கும், எனவே சில நேரங்களில் கணக்கிடப்பட்ட மதிப்பில் சிறிய இடைவெளி இருக்கலாம்.PCR எதிர்வினைகளை மேம்படுத்த, 54℃க்குக் குறையாத அனீலிங் வெப்பநிலையை உறுதிசெய்யும் மிகக் குறுகிய ப்ரைமர்கள் சிறந்த செயல்திறன் மற்றும் தனித்தன்மைக்கு பயன்படுத்தப்படுகின்றன.
ஒட்டுமொத்தமாக, ஒவ்வொரு கூடுதல் நியூக்ளியோடைடிற்கும் ப்ரைமர் விவரக்குறிப்பு நான்கு மடங்கு அதிகரிக்கிறது, இதனால் பெரும்பாலான பயன்பாடுகளுக்கான குறைந்தபட்ச ப்ரைமர் நீளம் 18 நியூக்ளியோடைடுகள் ஆகும்.ப்ரைமர் நீளத்தின் மேல் வரம்பு மிகவும் முக்கியமானது அல்ல, முக்கியமாக எதிர்வினை செயல்திறனுடன் தொடர்புடையது.என்ட்ரோபியின் காரணமாக, ப்ரைமர் நீளமானது, டிஎன்ஏ பாலிமரேஸை பிணைக்க ஒரு நிலையான இரட்டை இழைகள் கொண்ட டெம்ப்ளேட்டை உருவாக்க இலக்கு டிஎன்ஏவுடன் பிணைக்கப்படும் விகிதத்தை குறைக்கிறது.
ப்ரைமர்களை வடிவமைக்க மென்பொருளைப் பயன்படுத்தும் போது, ப்ரைமர்களின் நீளத்தை டிஎம் மதிப்பின் மூலம் தீர்மானிக்க முடியும், குறிப்பாக ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவு PCR ப்ரைமர்களுக்கு, TM=60℃ அல்லது கட்டுப்படுத்தப்பட வேண்டும்.
2.GC உள்ளடக்கம்
பொதுவாக, ப்ரைமர் வரிசைகளில் G+C இன் உள்ளடக்கம் 40%~60% ஆகும், மேலும் ஒரு ஜோடி ப்ரைமர்களின் GC உள்ளடக்கம் மற்றும் Tm மதிப்பு ஒருங்கிணைக்கப்பட வேண்டும்.ப்ரைமரில் தீவிரமான GC அல்லது AT போக்கு இருந்தால், ப்ரைமரின் 5' முடிவில் பொருத்தமான அளவு A, T அல்லது G மற்றும் C வால் சேர்க்கப்படும்.
3. அனீலிங் வெப்பநிலை
அனீலிங் வெப்பநிலையானது அன்செயின் வெப்பநிலையை விட 5℃ குறைவாக இருக்க வேண்டும்.ப்ரைமர் தளங்களின் எண்ணிக்கை சிறியதாக இருந்தால், அனீலிங் வெப்பநிலையை சரியான முறையில் அதிகரிக்கலாம், இது PCR இன் தனித்தன்மையை அதிகரிக்கலாம்.தளங்களின் எண்ணிக்கை பெரியதாக இருந்தால், அனீலிங் வெப்பநிலையை சரியான முறையில் குறைக்கலாம்.4℃ ~ 6℃ ஒரு ஜோடி ப்ரைமர்களுக்கு இடையேயான அனீலிங் வெப்பநிலை வேறுபாடு PCR விளைச்சலைப் பாதிக்காது, ஆனால் ஒரு ஜோடி ப்ரைமர்களின் அனீலிங் வெப்பநிலை ஒரே மாதிரியாக இருக்கும், இது 55℃ ~ 75℃ வரை மாறுபடும்.
4. பெருக்க டெம்ப்ளேட்டின் இரண்டாம் கட்டமைப்பு பகுதியை தவிர்க்கவும்
பெருக்கப்பட்ட துண்டைத் தேர்ந்தெடுக்கும்போது, டெம்ப்ளேட்டின் இரண்டாம் நிலைப் பகுதியைத் தவிர்ப்பது நல்லது.இலக்கு துண்டின் நிலையான இரண்டாம் கட்டமைப்பை தொடர்புடைய கணினி மென்பொருளால் கணித்து மதிப்பிட முடியும், இது டெம்ப்ளேட் தேர்வுக்கு உதவியாக இருக்கும்.விரிவாக்கப்பட வேண்டிய பிராந்தியத்தின் இலவச ஆற்றல் (△G) 58.6lkJ/mol க்கும் குறைவாக இருக்கும்போது விரிவாக்கம் பெரும்பாலும் தோல்வியடைகிறது என்பதை சோதனை முடிவுகள் காட்டுகின்றன.
5. இலக்கு டிஎன்ஏ உடன் பொருந்தாமை
பெருக்கப்பட்ட இலக்கு டிஎன்ஏ வரிசை பெரியதாக இருக்கும்போது, ஒரு ப்ரைமர் இலக்கு டிஎன்ஏவின் பல பகுதிகளுடன் பிணைக்கப்படலாம், இதன் விளைவாக பல பட்டைகள் விளைவாக தோன்றும்.இந்த நேரத்தில் BLAST மென்பொருள் சோதனை, இணையதளத்தைப் பயன்படுத்துவது அவசியம்:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.இரண்டு வரிசைகளை சீரமைப்பதைத் தேர்ந்தெடுக்கவும் (bl2seq).
மண்டலம் 1 க்கு ப்ரைமர் வரிசைகளையும், மண்டலம் 2 க்கு இலக்கு டிஎன்ஏ வரிசைகளையும் ஒட்டுவது ஒன்றுக்கொன்று மாறக்கூடியது, மேலும் BLAST ஆனது நிரப்பு, ஆன்டிசென்ஸ் மற்றும் பிற சாத்தியக்கூறுகளைக் கணக்கிடுகிறது, எனவே பயனர்கள் இரண்டு சங்கிலிகளும் உணர்வு சங்கிலிகளா என்பதை கவனிக்க வேண்டியதில்லை.தரவுத்தளத்தில் உள்ள வரிசையின் GI எண் உங்களுக்குத் தெரிந்தால், நீங்கள் GI எண்ணையும் உள்ளிடலாம், எனவே நீங்கள் வரிசையின் பெரிய பகுதியை ஒட்ட வேண்டியதில்லை.இறுதியாக, இலக்கு டிஎன்ஏவில் ப்ரைமரில் பல ஹோமோலோகஸ் தளங்கள் உள்ளதா என்பதைப் பார்க்க, 3 இல் சீரமை என்பதைக் கிளிக் செய்யவும்.
6. ப்ரைமர் டெர்மினல்
ப்ரைமரின் 3 'இறுதியானது நீட்டிப்பு தொடங்கும் இடமாகும், எனவே பொருத்தமற்றவை அங்கு தொடங்குவதைத் தடுப்பது முக்கியம்.3 'இறுதியானது 3 தொடர்ச்சியான G அல்லது C ஐ விட அதிகமாக இருக்கக்கூடாது, ஏனெனில் இது G+C செறிவூட்டல் வரிசைப் பகுதியில் ப்ரைமர் தவறாகத் தூண்டப்படும்.சிறப்பு PCR (AS-PCR) எதிர்வினைகளைத் தவிர, 3 'முடிவு எந்த இரண்டாம் கட்டமைப்பையும் உருவாக்க முடியாது, ப்ரைமரின் 3′ முடிவைப் பொருத்த முடியாது.எடுத்துக்காட்டாக, குறியாக்கப் பகுதி பெருக்கப்பட்டால், ப்ரைமரின் 3 'இறுதியானது கோடானின் மூன்றாவது நிலையில் நிறுத்தப்படக்கூடாது, ஏனெனில் மூன்றாம் நிலை கோடான் சிதைவடைய வாய்ப்புள்ளது, இது பெருக்கத்தின் தனித்தன்மையையும் செயல்திறனையும் பாதிக்கும்.இணைப்பு ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தும் போது, கோடான் பயன்பாட்டு அட்டவணையைப் பார்க்கவும், உயிரியல் விருப்பத்திற்கு கவனம் செலுத்தவும், 3′ முடிவில் இணைப்பு ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்த வேண்டாம், மேலும் அதிக செறிவு ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தவும் (1uM-3uM).
7. ப்ரைமர்களின் இரண்டாம் நிலை அமைப்பு
ப்ரைமர்கள் தாங்களே நிரப்பு வரிசைகளைக் கொண்டிருக்கக்கூடாது, இல்லையெனில் ப்ரைமர்கள் ஹேர்பின் அமைப்புகளாக மடிந்துவிடும், மேலும் இந்த இரண்டாம் நிலை அமைப்பு ஸ்டெரிக் தடையின் காரணமாக ப்ரைமர்கள் மற்றும் டெம்ப்ளேட்களின் பிணைப்பை பாதிக்கும்.செயற்கையான தீர்ப்பு பயன்படுத்தப்பட்டால், ப்ரைமர்களின் தொடர்ச்சியான நிரப்பு தளங்கள் 3bp ஐ விட அதிகமாக இருக்கக்கூடாது.இரண்டு ப்ரைமர்களுக்கு இடையே எந்த ஒரு நிரப்புத்தன்மையும் இருக்கக்கூடாது, குறிப்பாக ப்ரைமர் டைமர்கள் உருவாவதைத் தடுக்க, 3 'எண்டின் நிரப்பு ஒன்றுடன் ஒன்று தவிர்க்கப்பட வேண்டும்.பொதுவாக, ஒரு ஜோடி ப்ரைமர்களுக்கு இடையே 4 தொடர்ச்சியான அடிப்படைகள் ஹோமோலஜி அல்லது நிரப்புத்தன்மைக்கு மேல் இருக்கக்கூடாது.
8. குறிப்பான்கள் அல்லது இடங்களைச் சேர்க்கவும்
5 'முடிவு பெருக்க விவரக்குறிப்பில் சிறிதளவு தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது, எனவே பெருக்க விவரக்குறிப்பை பாதிக்காமல் மாற்றலாம்.ப்ரைமர் 5'இன் மாற்றத்தில் சேர்க்கப்பட்டுள்ளது: என்சைம் கட்டுப்பாடு தளத்தைச் சேர்த்தல்;பெயரிடப்பட்ட பயோட்டின், ஃப்ளோரசன்ஸ், டிகோக்சின், Eu3+ போன்றவை. புரத பிணைப்பு டிஎன்ஏ வரிசைகளை அறிமுகப்படுத்துகின்றன;பிறழ்வுத் தளங்களை அறிமுகப்படுத்துதல், பிறழ்வு வரிசைகளைச் செருகுதல் மற்றும் காணவில்லை, ஊக்குவிப்பாளர் தொடர்களை அறிமுகப்படுத்துதல் போன்றவை. கூடுதல் தளங்கள் பெருக்கத்தின் செயல்திறனை அதிகமாகவோ அல்லது குறைவாகவோ பாதிக்கும் மற்றும் ப்ரைமர் டைமர் உருவாவதற்கான வாய்ப்பை அதிகரிக்கும், ஆனால் அடுத்த கட்டத்திற்கு சில சலுகைகள் செய்யப்பட வேண்டும்.இலக்கு வரிசையில் இல்லாத கூடுதல் வரிசைகளான கட்டுப்பாடு தளங்கள் மற்றும் ஊக்குவிப்பாளர் வரிசைகள், குறிப்பிட்ட தன்மையை பாதிக்காமல் ப்ரைமரின் 5′ முடிவில் சேர்க்கலாம்.இந்த வரிசைகள் ப்ரைமர் டிஎம் மதிப்புகளின் கணக்கீட்டில் சேர்க்கப்படவில்லை, ஆனால் நிரப்புத்தன்மை மற்றும் உள் இரண்டாம் நிலை அமைப்புக்காக சோதிக்கப்பட வேண்டும்.
9. துணை குளோன்கள்
பெரும்பாலான நேரங்களில், PCR என்பது பூர்வாங்க குளோனிங் மட்டுமே, அதன் பிறகு நாம் இலக்கு துண்டுகளை பல்வேறு திசையன்களாக துணைக் குளோன் செய்ய வேண்டும், எனவே PCR படியில் அடுத்த செயல்பாட்டிற்கான கூடுதல் தளங்களை வடிவமைக்க வேண்டும்.
துணை குளோனிங்கிற்காக வடிவமைக்கப்பட்ட சில காட்சிகள் கீழே சுருக்கப்பட்டுள்ளன.
கட்டுப்பாடு எண்டோநியூக்லீஸ் கட்டுப்பாடு தளம் சேர்க்கப்பட்டது
என்சைம் கட்டுப்பாடு தளங்களைச் சேர்ப்பது பிசிஆர் தயாரிப்புகளை துணைக் குளோனிங் செய்வதற்கு பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் முறையாகும்.பொதுவாக, பிளவு தளம் ஆறு தளங்கள், பிளவு தளத்தின் 5 'முடிவிற்கு கூடுதலாக 2 ~ 3 பாதுகாப்பு தளங்களை சேர்க்க வேண்டும்.இருப்பினும், வெவ்வேறு நொதிகளுக்கு தேவைப்படும் பாதுகாப்பு தளங்களின் எண்ணிக்கை வேறுபட்டது.எடுத்துக்காட்டாக, SalⅠ க்கு பாதுகாப்புத் தளம் தேவையில்லை, EcoRⅤக்கு 1 பாதுகாப்புத் தளம் தேவை, NotⅠ க்கு 2 பாதுகாப்புத் தளங்கள் தேவை, மற்றும் Hind Ⅲக்கு 3 பாதுகாப்புத் தளங்கள் தேவை.
எல்ஐசி வால் சேர்க்கிறது
எல்ஐசியின் முழுப் பெயர் லிகேஷன்-இன்டிபென்டன்ட் குளோனிங் ஆகும், இது பிஇடி வெக்டரின் ஒரு பகுதிக்காக குறிப்பாக நவோஜென் கண்டுபிடித்த குளோனிங் முறையாகும்.எல்ஐசி முறையால் தயாரிக்கப்பட்ட பிஇடி கேரியர் நிரப்பு அல்லாத 12-15 அடிப்படை ஒற்றை இழை ஒட்டும் முனைகளைக் கொண்டுள்ளது, இது இலக்கு செருகும் துண்டில் தொடர்புடைய ஒட்டும் முனைகளை நிறைவு செய்கிறது.பெருக்க நோக்கங்களுக்காக, செருகப்பட்ட துண்டின் ப்ரைமர் 5′ வரிசை LIC வெக்டரை முழுமையாக்க வேண்டும்.T4 டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் 3′→5′ எக்ஸ்ட்ரானெக்ட் செயல்பாடு சிறிது நேரத்திற்குப் பிறகு செருகப்பட்ட துண்டில் ஒற்றை இழை ஒட்டும் முடிவை உருவாக்கலாம்.தயாரிக்கப்பட்ட செருகும் துண்டு மற்றும் திசையன் ஆகியவற்றின் பரஸ்பர அனீலிங் மூலம் மட்டுமே தயாரிப்பு உருவாக்கப்பட முடியும் என்பதால், இந்த முறை மிகவும் வேகமாகவும் திறமையாகவும் இருக்கிறது, மேலும் இது குளோனிங் இயக்கப்படுகிறது.
இயக்கிய TA குளோன் ஆட் டெயில்
TA குளோனிங்கால் துண்டத்தை ஒரு வெக்டரில் குறிவைக்க முடியவில்லை, எனவே பின்னர் இன்விட்ரஜன் குளோனிங்கை குறிவைக்கக்கூடிய ஒரு திசையன் அறிமுகப்படுத்தியது, அதில் ஒரு முனையில் நான்கு முக்கிய அடிப்படை GTGGS இருந்தது.எனவே, PCR ப்ரைமர்களின் வடிவமைப்பில், அதற்கேற்ப நிரப்பு வரிசைகள் சேர்க்கப்பட வேண்டும், இதனால் துண்டுகள் "சார்ந்ததாக" இருக்கும்.
உங்களுக்கு நேரம் குறைவாக இருந்தால், மரபணுவை வெக்டருடன் இணைத்து, நேரடித் தொகுப்பை முயற்சி செய்யலாம், இதைத்தான் நாங்கள் ET மரபணு தொகுப்பு என்று இசைக்கலைஞர்களில் அழைக்கிறோம்.
D. இன்-ஃப்யூஷன் குளோனிங் முறை
லிகேஸ் தேவையில்லை, நீண்ட எதிர்வினை தேவையில்லை.ப்ரைமர்களின் வடிவமைப்பில் நேர்கோட்டு திசையன் இரு முனைகளிலும் ஒரு வரிசை அறிமுகப்படுத்தப்படும் வரை, பிசிஆர் தயாரிப்பு மற்றும் நேரியல் திசையன் ஆகியவை பிஎஸ்ஏ கொண்ட இன்-ஃப்யூஷன் என்சைம் கரைசலில் சேர்க்கப்பட்டு அறை வெப்பநிலையில் அரை மணி நேரம் வைக்கப்படும் வரை, மாற்றத்தை நிகழ்த்த முடியும்.இந்த முறை பெரிய தொகுதி மாற்றத்திற்கு மிகவும் பொருத்தமானது.
10. ப்ரைமரை ஒன்றிணைக்கவும்
சில நேரங்களில், ப்ரைமர் வடிவமைப்பு பற்றி வரையறுக்கப்பட்ட வரிசை தகவல் மட்டுமே அறியப்படுகிறது.எடுத்துக்காட்டாக, அமினோ அமில வரிசை மட்டுமே தெரிந்தால், ஒன்றிணைக்கும் ப்ரைமரை வடிவமைக்க முடியும்.ஒரு இணைப்பு ப்ரைமர் என்பது ஒரு அமினோ அமிலத்தை குறியாக்கம் செய்யும் பல்வேறு அடிப்படை சாத்தியக்கூறுகளைக் குறிக்கும் வெவ்வேறு வரிசைகளின் கலவையாகும்.தனித்தன்மையை அதிகரிக்க, வெவ்வேறு உயிரினங்களின் அடிப்படை பயன்பாட்டு விருப்பங்களின்படி இணைப்பதைக் குறைக்க கோடான் பயன்பாட்டு அட்டவணையைப் பார்க்கவும்.ப்ரைமரின் அனீலிங் வெப்பநிலையைக் குறைக்க ஹைபோக்சாந்தைனை அனைத்து தளங்களுடனும் இணைக்கலாம்.ப்ரைமரின் 3′ முடிவில் இணைக்கப்பட்ட தளங்களைப் பயன்படுத்த வேண்டாம், ஏனெனில் தவறான தளத்தில் PCR ஐத் தொடங்க 3′ முடிவில் கடைசி 3 தளங்களின் அனீலிங் போதுமானது.அதிக ப்ரைமர் செறிவுகள் (1μM முதல் 3μM வரை) பயன்படுத்தப்படுகின்றன, ஏனெனில் பல இணைப்பு கலவைகளில் உள்ள ப்ரைமர்கள் இலக்கு டெம்ப்ளேட்டிற்கு குறிப்பிட்டதாக இல்லை.
பிசிஆர் மூலப்பொருட்கள்கட்டுப்பாடு
1. ப்ரைமர் அளவு
ஒவ்வொரு ப்ரைமரின் செறிவு 0.1 ~ 1umol அல்லது 10 ~ 100pmol ஆகும்.குறைந்த அளவு ப்ரைமருடன் தேவையான முடிவை உருவாக்குவது நல்லது.ப்ரைமரின் அதிக செறிவு பொருத்தமின்மை மற்றும் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்தை ஏற்படுத்தும், மேலும் ப்ரைமர்களுக்கு இடையில் டைமர்களை உருவாக்கும் வாய்ப்பை அதிகரிக்கும்.
2. ப்ரைமர் செறிவு
ப்ரைமர்களின் செறிவு தனித்தன்மையை பாதிக்கிறது.உகந்த ப்ரைமர் செறிவு பொதுவாக 0.1 மற்றும் 0.5μM வரை இருக்கும்.அதிக ப்ரைமர் செறிவுகள் குறிப்பிடப்படாத தயாரிப்புகளின் பெருக்கத்திற்கு வழிவகுக்கும்.
3. ப்ரைமரின் அனீலிங் வெப்பநிலை
ப்ரைமர்களுக்கான மற்றொரு முக்கியமான அளவுரு உருகும் வெப்பநிலை (Tm) ஆகும்.50% ப்ரைமர்கள் மற்றும் நிரப்பு வரிசைகள் இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏ மூலக்கூறுகளாக குறிப்பிடப்படும் போது இது வெப்பநிலையாகும்.PCR அனீலிங் வெப்பநிலையை அமைக்க Tm தேவை.வெறுமனே, அனீலிங் வெப்பநிலையானது இலக்கு வரிசையுடன் ப்ரைமர்களின் திறம்பட அனீலிங் செய்வதை உறுதிசெய்யும் அளவுக்கு குறைவாக உள்ளது, ஆனால் குறிப்பிடப்படாத பிணைப்பைக் குறைக்கும் அளவுக்கு அதிகமாக உள்ளது.55℃ முதல் 70℃ வரை நியாயமான அனீலிங் வெப்பநிலை.அனீலிங் வெப்பநிலை பொதுவாக ப்ரைமரின் Tm ஐ விட 5℃ குறைவாக அமைக்கப்படுகிறது.
Tm அமைப்பதற்கு பல சூத்திரங்கள் உள்ளன, அவை பயன்படுத்தப்படும் சூத்திரம் மற்றும் ப்ரைமர்களின் வரிசையைப் பொறுத்து பெரிதும் மாறுபடும்.பெரும்பாலான சூத்திரங்கள் மதிப்பிடப்பட்ட Tm மதிப்பை வழங்குவதால், அனைத்து அனீலிங் வெப்பநிலைகளும் ஒரு தொடக்க புள்ளியாக மட்டுமே இருக்கும்.அனீலிங் வெப்பநிலையை படிப்படியாக உயர்த்தும் பல எதிர்வினைகளை பகுப்பாய்வு செய்வதன் மூலம் குறிப்பிட்ட தன்மையை மேம்படுத்தலாம்.மதிப்பிடப்பட்ட Tm-5℃க்குக் கீழே தொடங்கி, 2℃ இன் அதிகரிப்பில் அனீலிங் வெப்பநிலையை படிப்படியாக அதிகரிக்கவும்.அதிக அனீலிங் வெப்பநிலை ப்ரைமர் டைமர்கள் மற்றும் குறிப்பிட்ட அல்லாத தயாரிப்புகளின் உருவாக்கத்தை குறைக்கும்.சிறந்த முடிவுகளுக்கு, இரண்டு ப்ரைமர்களும் தோராயமான Tm மதிப்புகளைக் கொண்டிருக்க வேண்டும்.ப்ரைமர் ஜோடிகளின் Tm வேறுபாடு 5℃க்கு மேல் இருந்தால், சுழற்சியில் குறைந்த அனீலிங் வெப்பநிலையைப் பயன்படுத்தி ப்ரைமர்கள் குறிப்பிடத்தக்க தவறான தொடக்கத்தைக் காண்பிக்கும்.இரண்டு ப்ரைமர்கள் Tm வேறுபட்டால், அனீலிங் வெப்பநிலையை குறைந்தபட்ச Tm ஐ விட 5℃ குறைவாக அமைக்கவும்.மாற்றாக, குறிப்பிட்ட தன்மையை அதிகரிக்க, அதிக Tm க்காக வடிவமைக்கப்பட்ட அனீலிங் வெப்பநிலையில் முதலில் ஐந்து சுழற்சிகள் செய்யப்படலாம், அதன்பின் மீதமுள்ள சுழற்சிகள் குறைந்த Tmக்காக வடிவமைக்கப்பட்ட அனீலிங் வெப்பநிலையில் செய்யப்படலாம்.இது இலக்கு டெம்ப்ளேட்டின் பகுதி நகலை இறுக்கமான சூழ்நிலையில் பெற அனுமதிக்கிறது.
4. ப்ரைமர் தூய்மை மற்றும் நிலைத்தன்மை
தனிப்பயன் ப்ரைமர்களின் நிலையான தூய்மை பெரும்பாலான PCR பயன்பாடுகளுக்கு போதுமானது.டீசால்டிங் மூலம் பென்சாயில் மற்றும் ஐசோபியூட்டிலைல் குழுக்களை அகற்றுவது மிகக் குறைவு, எனவே PCR உடன் தலையிடாது.சில பயன்பாடுகளுக்கு தொகுப்பு செயல்பாட்டில் முழு நீளம் இல்லாத தொடர்களை அகற்ற சுத்திகரிப்பு தேவைப்படுகிறது.டிஎன்ஏ தொகுப்பு வேதியியலின் செயல்திறன் 100% இல்லாமையால் இந்த துண்டிக்கப்பட்ட தொடர்கள் ஏற்படுகின்றன.3′ முதல் 5′ வரை டிஎன்ஏவை உருவாக்க ஒவ்வொரு தளமும் சேர்க்கப்படுவதால், மீண்டும் மீண்டும் இரசாயன எதிர்வினைகளைப் பயன்படுத்தும் ஒரு வட்டச் செயல்முறை இது.நீங்கள் எந்த சுழற்சியிலும் தோல்வியடையலாம்.நீண்ட ப்ரைமர்கள், குறிப்பாக 50 தளங்களுக்கு மேல் உள்ளவை, துண்டிக்கப்பட்ட வரிசைகளின் பெரிய விகிதத்தைக் கொண்டுள்ளன, மேலும் அவை சுத்திகரிப்பு தேவைப்படலாம்.
ப்ரைமர்களின் விளைச்சல் செயற்கை வேதியியல் மற்றும் சுத்திகரிப்பு முறையின் செயல்திறனால் பாதிக்கப்படுகிறது.சைட்டாலஜி மற்றும் ஷெங்காங் போன்ற உயிரி மருந்து நிறுவனங்கள் அனைத்தும் ஒலிகோநியூக்ளியோசைட்டின் மொத்த வெளியீட்டை உறுதி செய்ய குறைந்தபட்ச OD யூனிட்டைப் பயன்படுத்துகின்றன.தனிப்பயன் ப்ரைமர்கள் உலர்ந்த தூள் வடிவில் அனுப்பப்படுகின்றன.TE இல் ப்ரைமர்களை மீண்டும் கரைப்பது சிறந்தது, இதனால் இறுதி செறிவு 100μM ஆகும்.டீயோனைஸ்டு நீரை விட TE சிறந்தது, ஏனெனில் நீரின் pH பெரும்பாலும் அமிலமானது மற்றும் ஒலிகோநியூக்ளியோசைடுகளின் நீராற்பகுப்பை ஏற்படுத்தும்.
ப்ரைமர்களின் நிலைத்தன்மை சேமிப்பக நிலைமைகளைப் பொறுத்தது.உலர் தூள் மற்றும் கரைந்த ப்ரைமர்கள் -20℃ இல் சேமிக்கப்பட வேண்டும்.10μM க்கும் அதிகமான செறிவுகளில் TE இல் கரைக்கப்பட்ட ப்ரைமர்கள் -20℃ இல் 6 மாதங்களுக்கு நிலையானதாக சேமிக்கப்படும், ஆனால் அறை வெப்பநிலையில் (15℃ முதல் 30℃ வரை) 1 வாரத்திற்கும் குறைவாக மட்டுமே சேமிக்க முடியும்.உலர் தூள் ப்ரைமர்கள் குறைந்தபட்சம் 1 வருடத்திற்கு -20 C மற்றும் அறை வெப்பநிலையில் (15 C முதல் 30 C வரை) 2 மாதங்கள் வரை சேமிக்கப்படும்.
5. என்சைம்கள் மற்றும் அவற்றின் செறிவுகள்
தற்போது, Taq DNA பாலிமரேஸ் என்பது கோலிஃபார்ம் பாக்டீரியாவால் தொகுக்கப்பட்ட மரபணு பொறியியல் என்சைம் ஆகும்.ஒரு பொதுவான PCR வினையை வினையூக்க தேவையான நொதியின் அளவு சுமார் 2.5U (100ul இன் மொத்த எதிர்வினை அளவைக் குறிக்கிறது).செறிவு மிக அதிகமாக இருந்தால், அது குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்திற்கு வழிவகுக்கும்;செறிவு மிகக் குறைவாக இருந்தால், செயற்கை உற்பத்தியின் அளவு குறைக்கப்படும்.
6. dNTP இன் தரம் மற்றும் செறிவு
டிஎன்டிபியின் தரமானது பிசிஆர் பெருக்கத்தின் செறிவு மற்றும் செயல்திறனுடன் நெருக்கமாக தொடர்புடையது.dNTP தூள் சிறுமணியானது, அது தவறாக சேமிக்கப்பட்டால் அதன் மாறுபாடு அதன் உயிரியல் செயல்பாட்டை இழக்கிறது.dNTP கரைசல் அமிலமானது, மேலும் 1M NaOH அல்லது 1M Tris.HCL இடையகக் கரைசலுடன் அதன் PHஐ 7.0 ~ 7.5 ஆக மாற்றியமைக்க, அதிக செறிவூட்டலில் பயன்படுத்தப்பட வேண்டும், சிறிய அளவிலான துணை பேக்கேஜிங், உறைந்த சேமிப்பு -20℃.பல முடக்கம்-தாவிங் டிஎன்டிபியை சிதைக்கும்.PCR எதிர்வினையில், dNTP 50 ~ 200umol/L ஆக இருக்க வேண்டும்.குறிப்பாக, நான்கு டிஎன்டிபிஎஸ் செறிவு சமமாக இருக்க வேண்டும் (சம மோல் தயாரிப்பு) கவனம் செலுத்த வேண்டும்.அவற்றில் ஏதேனும் ஒன்றின் செறிவு மற்றவற்றிலிருந்து வேறுபட்டால் (அதிக அல்லது குறைந்த), பொருத்தமின்மை ஏற்படும்.மிகக் குறைந்த செறிவு PCR தயாரிப்புகளின் விளைச்சலைக் குறைக்கும்.dNTP ஆனது Mg2+ உடன் இணைந்து இலவச Mg2+ இன் செறிவைக் குறைக்கும்.
7. டெம்ப்ளேட் (இலக்கு மரபணு) நியூக்ளிக் அமிலம்
வார்ப்புரு நியூக்ளிக் அமிலத்தின் அளவு மற்றும் சுத்திகரிப்பு அளவு PCR இன் வெற்றி அல்லது தோல்விக்கான முக்கிய இணைப்புகளில் ஒன்றாகும்.பாரம்பரிய டிஎன்ஏ சுத்திகரிப்பு முறைகள் பொதுவாக எஸ்டிஎஸ் மற்றும் புரோட்டீஸ் கே மாதிரிகளை ஜீரணிக்க மற்றும் அப்புறப்படுத்த பயன்படுத்துகின்றன.SDS இன் முக்கிய செயல்பாடுகள்: உயிரணு சவ்வு மீது கொழுப்பு மற்றும் புரதங்களைக் கரைத்து, சவ்வு புரதங்களைக் கரைப்பதன் மூலம் உயிரணு சவ்வை அழிக்கிறது, மேலும் அணுக்கரு புரதங்களை கலத்தில் பிரிக்கிறது, SDS ஆனது புரதங்களுடன் ஒன்றிணைந்து வீழ்படியும்;புரோட்டீஸ் கே ஆனது புரதங்களை ஹைட்ரோலைஸ் செய்து ஜீரணிக்க முடியும், குறிப்பாக டிஎன்ஏவுடன் பிணைக்கப்பட்ட ஹிஸ்டோன்கள், பின்னர் புரதங்கள் மற்றும் பிற செல் கூறுகளை பிரித்தெடுக்க ஆர்கானிக் கரைப்பான் பீனால் மற்றும் குளோரோஃபார்ம் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்துகிறது, மேலும் நியூக்ளிக் அமிலத்தைத் தூண்டுவதற்கு எத்தனால் அல்லது ஐசோபிரைல் ஆல்கஹாலைப் பயன்படுத்துகிறது.பிரித்தெடுக்கப்பட்ட நியூக்ளிக் அமிலம் PCR எதிர்வினைகளுக்கான டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தப்படலாம்.பொதுவான மருத்துவ கண்டறிதல் மாதிரிகளுக்கு, விரைவான மற்றும் எளிமையான முறையானது செல்களைக் கரைக்கவும், நோய்க்கிருமிகளை லைசேட் செய்யவும், குரோமோசோம்களிலிருந்து இலவச இலக்கு மரபணுக்களுக்கு புரதங்களை ஜீரணிக்கவும் அகற்றவும் மற்றும் PCR பெருக்கத்திற்கு நேரடியாகப் பயன்படுத்தப்படலாம்.ஆர்என்ஏ டெம்ப்ளேட் பிரித்தெடுத்தல் பொதுவாக குவானிடைன் ஐசோதியோசயனேட் அல்லது புரோட்டீஸ் கே முறையைப் பயன்படுத்தி ஆர்என்ஏவை சிதைப்பதைத் தடுக்கிறது.
8.Mg2+ செறிவு
PCR பெருக்கத்தின் தனித்தன்மை மற்றும் விளைச்சலில் Mg2+ குறிப்பிடத்தக்க விளைவைக் கொண்டுள்ளது.பொது PCR எதிர்வினையில், பல்வேறு dNTPயின் செறிவு 200umol/L ஆக இருக்கும் போது, Mg2+ இன் பொருத்தமான செறிவு 1.5 ~ 2.0mmol/L ஆகும்.Mg2+ செறிவு மிக அதிகமாக உள்ளது, வினைத் தனித்தன்மை குறைகிறது, குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கம் ஏற்படுகிறது, மிகக் குறைந்த செறிவு Taq DNA பாலிமரேஸின் செயல்பாட்டைக் குறைக்கும், இதன் விளைவாக எதிர்வினை தயாரிப்புகள் குறையும்.
மக்னீசியம் அயனிகள் PCR இன் பல அம்சங்களை பாதிக்கின்றன, DNA பாலிமரேஸ் செயல்பாடு, இது விளைச்சலை பாதிக்கிறது;மற்றொரு உதாரணம் ப்ரைமர் அனீலிங், இது குறிப்பிட்ட தன்மையை பாதிக்கிறது.dNTP மற்றும் டெம்ப்ளேட் மெக்னீசியம் அயனுடன் பிணைக்கிறது, நொதி செயல்பாட்டிற்கு தேவையான இலவச மெக்னீசியம் அயனியின் அளவைக் குறைக்கிறது.வெவ்வேறு ப்ரைமர் ஜோடிகள் மற்றும் டெம்ப்ளேட்டுகளுக்கு உகந்த மெக்னீசியம் அயனி செறிவு மாறுபடும், ஆனால் 200μM dNTP உடன் ஒரு பொதுவான PCR தொடக்க செறிவு 1.5mM ஆகும் (குறிப்பு: நிகழ்நேர அளவு PCRக்கு, 3 முதல் 5mM மெக்னீசியம் அயன் கரைசலை ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வுடன் பயன்படுத்தவும்).இலவச மெக்னீசியம் அயனிகளின் அதிக செறிவு விளைச்சலை அதிகரிக்கிறது, ஆனால் குறிப்பிடப்படாத பெருக்கத்தை அதிகரிக்கிறது மற்றும் நம்பகத்தன்மையை குறைக்கிறது.உகந்த செறிவைத் தீர்மானிக்க, மெக்னீசியம் அயன் டைட்ரேஷன்கள் 1mM முதல் 3mM வரை 0.5mM அதிகரிப்புகளில் செய்யப்பட்டன.மெக்னீசியம் அயன் உகப்பாக்கத்தைச் சார்ந்திருப்பதைக் குறைக்க, பிளாட்டினம் டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸைப் பயன்படுத்தலாம்.பிளாட்டினம் டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ், டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸைக் காட்டிலும் பரந்த அளவிலான மெக்னீசியம் அயன் செறிவுகளில் செயல்பாட்டைப் பராமரிக்க முடியும், எனவே குறைந்த தேர்வுமுறை தேவைப்படுகிறது.
9. Pcr-ஊக்குவிக்கும் சேர்க்கைகள்
அனீலிங் வெப்பநிலை, ப்ரைமர் வடிவமைப்பு மற்றும் மெக்னீசியம் அயன் செறிவு ஆகியவற்றின் மேம்படுத்தல் பெரும்பாலான டெம்ப்ளேட்களின் மிகவும் குறிப்பிட்ட பெருக்கத்திற்கு போதுமானது;இருப்பினும், உயர் GC உள்ளடக்கம் உள்ளவை உட்பட சில டெம்ப்ளேட்டுகளுக்கு கூடுதல் நடவடிக்கைகள் தேவை.டிஎன்ஏவின் உருகும் வெப்பநிலையைப் பாதிக்கும் சேர்க்கைகள் தயாரிப்புத் தன்மை மற்றும் விளைச்சலை மேம்படுத்த மற்றொரு வழியை வழங்குகிறது.சிறந்த முடிவுகளுக்கு டெம்ப்ளேட்டின் முழு குறைப்பு தேவை.
கூடுதலாக, இரண்டாம் நிலை அமைப்பு ப்ரைமர் பிணைப்பு மற்றும் என்சைம் நீட்டிப்பைத் தடுக்கிறது.
ஃபார்மைடு, டிஎம்எஸ்ஓ, கிளிசரின், பீடைன் மற்றும் பிசிஆர்எக்ஸ் என்ஹான்சர் சொல்யூஷன் உள்ளிட்ட பிசிஆர் சேர்க்கைகள் பெருக்கத்தை மேம்படுத்துகின்றன.அவற்றின் சாத்தியமான பொறிமுறையானது உருகும் வெப்பநிலையைக் குறைப்பதாகும், இதனால் ப்ரைமர்களின் அனீலிங் மற்றும் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பு பகுதி வழியாக டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் நீட்டிப்புக்கு உதவுகிறது.PCRx தீர்வு மற்ற நன்மைகளையும் கொண்டுள்ளது.பிளாட்டினம் டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் மற்றும் பிளாட்டினம் பிஎஃப்எக்ஸ் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தும் போது குறைந்தபட்ச மெக்னீசியம் அயன் தேர்வுமுறை தேவைப்படுகிறது.எனவே, பிளாட்டினம் நுட்பமானது, மூன்றாம் அணுகுமுறையான மெக்னீசியம் அயனி உகப்பாக்கத்தின் சார்புநிலையைக் குறைக்கும் அதே வேளையில் குறிப்பிட்ட தன்மையை அதிகரிக்க சேர்க்கையுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளது.சிறந்த முடிவுகளுக்கு, சேர்க்கைகளின் செறிவு உகந்ததாக இருக்க வேண்டும், குறிப்பாக டிஎம்எஸ்ஓ, ஃபார்மைடு மற்றும் கிளிசரால் ஆகியவை டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸைத் தடுக்கின்றன.
10. சூடான தொடக்கம்
ஹாட் ஸ்டார்ட் பிசிஆர் என்பது நல்ல ப்ரைமர் வடிவமைப்புடன் கூடுதலாக பிசிஆர் விவரக்குறிப்பை மேம்படுத்துவதற்கான மிக முக்கியமான முறைகளில் ஒன்றாகும்.Taq DNA பாலிமரேஸின் உகந்த நீள வெப்பநிலை 72℃ என்றாலும், பாலிமரேஸ் அறை வெப்பநிலையில் செயலில் உள்ளது.இவ்வாறு, பிசிஆர் எதிர்வினை தயாரிப்பின் போது மற்றும் வெப்ப சுழற்சியின் தொடக்கத்தில் வைத்திருக்கும் வெப்பநிலை அனீலிங் வெப்பநிலையை விட குறைவாக இருக்கும் போது குறிப்பிடப்படாத பொருட்கள் உற்பத்தி செய்யப்படுகின்றன.உருவாக்கப்பட்டவுடன், இந்த குறிப்பிடப்படாத தயாரிப்புகள் திறம்பட பெருக்கப்படுகின்றன.ப்ரைமர் வடிவமைப்பிற்குப் பயன்படுத்தப்படும் தளங்கள், தளம் சார்ந்த பிறழ்வுகள், வெளிப்பாடு குளோனிங், அல்லது டிஎன்ஏ பொறியியலுக்குப் பயன்படுத்தப்படும் மரபணுக் கூறுகளின் கட்டுமானம் மற்றும் கையாளுதல் போன்ற மரபணுக் கூறுகளின் இருப்பிடத்தால் வரையறுக்கப்படும் போது ஹாட்-ஸ்டார்ட் PCR குறிப்பாக பயனுள்ளதாக இருக்கும்.
டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் செயல்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்துவதற்கான ஒரு பொதுவான முறை, ஐஸ் மீது PCR எதிர்வினை கரைசலை தயார் செய்து, அதை முன்கூட்டியே சூடேற்றப்பட்ட PCR கருவியில் வைப்பதாகும்.இந்த முறை எளிமையானது மற்றும் மலிவானது, ஆனால் இது நொதியின் செயல்பாட்டை நிறைவு செய்யாது, எனவே குறிப்பிட்ட அல்லாத பொருட்களின் பெருக்கத்தை முற்றிலும் அகற்றாது.
பிசிஆர் எந்திரம் டினாட்டரேஷன் வெப்பநிலையை அடையும் வரை வெப்ப ப்ரைமிங் டிஎன்ஏ தொகுப்பைத் தடுக்கிறது.Taq DNA பாலிமரேஸை தாமதமாகச் சேர்ப்பது உட்பட பெரும்பாலான கையேடு வெப்ப துவக்க முறைகள் சிக்கலானவை, குறிப்பாக உயர்-செயல்திறன் பயன்பாடுகளுக்கு.மற்ற தெர்மல் ப்ரைமிங் முறைகள் மெக்னீசியம் அயனிகள் அல்லது என்சைம்கள் உள்ளிட்ட அத்தியாவசிய கூறுகளை இணைக்க அல்லது வார்ப்புருக்கள் மற்றும் பஃபர்கள் போன்ற எதிர்வினை கூறுகளை உடல் ரீதியாக தனிமைப்படுத்த மெழுகு கவசத்தைப் பயன்படுத்துகின்றன.வெப்ப சுழற்சியின் போது, பல்வேறு கூறுகள் வெளியிடப்பட்டு மெழுகு உருகும்போது ஒன்றாக கலக்கப்படுகின்றன.மேனுவல் ஹாட் ஸ்டார்ட் முறையைப் போலவே, மெழுகுக் கவச முறையும் சிக்கலானது மற்றும் மாசுபடுவதற்கு வாய்ப்புள்ளது மற்றும் அதிக செயல்திறன் பயன்பாடுகளுக்கு ஏற்றது அல்ல.
பிளாட்டினம் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் தானியங்கி சூடான தொடக்க PCRக்கு வசதியானது மற்றும் திறமையானது.பிளாட்டினம் டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ், டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸுக்கு எதிராக மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடியுடன் இணைந்து மறுசீரமைப்பு டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸைக் கொண்டுள்ளது.ஆன்டிபாடிகள் பிசிஆர் மூலம் நீண்ட நேரம் வெப்பநிலையை வைத்திருக்கும் போது என்சைம் செயல்பாட்டைத் தடுக்கின்றன.டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் 94℃ இன்சுலேஷனின் போது வினையில் வெளியிடப்பட்டது, இது முழு பாலிமரேஸ் செயல்பாட்டை மீட்டெடுக்கிறது.வெப்ப துவக்கத்திற்காக வேதியியல் முறையில் மாற்றியமைக்கப்பட்ட Taq DNA பாலிமரேஸைப் போலல்லாமல், பாலிமரேஸைச் செயல்படுத்த பிளாட்டினம் நொதிக்கு 94℃ (10 முதல் 15 நிமிடங்கள்) நீடித்த காப்புத் தேவை இல்லை.PlatinumTaq DNA பாலிமரேஸ் மூலம், Taq DNA பாலிமரேஸ் செயல்பாட்டின் 90% 2 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு 94℃ இல் மீட்டெடுக்கப்பட்டது.
11. நெஸ்ட்-பிசிஆர்
உள்ளமைக்கப்பட்ட ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி அடுத்தடுத்த சுற்று பெருக்கங்கள் குறிப்பிட்ட தன்மையையும் உணர்திறனையும் மேம்படுத்தலாம்.முதல் சுற்று 15 முதல் 20 சுழற்சிகளின் நிலையான பெருக்கம் ஆகும்.ஆரம்ப பெருக்க உற்பத்தியின் ஒரு சிறிய பகுதி 100 முதல் 1000 முறை நீர்த்தப்பட்டு 15 முதல் 20 சுழற்சிகளுக்கு இரண்டாவது சுற்று பெருக்கத்தில் சேர்க்கப்பட்டது.மாற்றாக, ஆரம்ப பெருக்கப்பட்ட தயாரிப்பு ஜெல் சுத்திகரிப்பு மூலம் அளவிடப்படலாம்.ஒரு உள்ளமைக்கப்பட்ட ப்ரைமர் இரண்டாவது சுற்று பெருக்கத்தில் பயன்படுத்தப்படுகிறது, இது முதல் ப்ரைமருக்குள் இலக்கு வரிசையுடன் பிணைக்க முடியும்.உள்ளமைக்கப்பட்ட PCR இன் பயன்பாடு பல இலக்கு தளங்களின் பெருக்கத்தின் சாத்தியத்தை குறைக்கிறது, ஏனெனில் இரண்டு செட் ப்ரைமர்களுக்கும் சில இலக்கு வரிசைகள் நிரப்புகின்றன.அதே ப்ரைமர்களுடன் அதே மொத்த சுழற்சிகள் (30 முதல் 40 வரை) குறிப்பிடப்படாத தளங்களைப் பெருக்கின.உள்ளமைக்கப்பட்ட PCR வரையறுக்கப்பட்ட இலக்கு வரிசைகளின் உணர்திறனை அதிகரிக்கிறது (எ.கா., அரிதான mrnas) மற்றும் கடினமான PCRS (எ.கா. 5′ RACE) இன் தனித்தன்மையை மேம்படுத்துகிறது.
12. இறங்கு PCR
PCR இன் முதல் சில சுழற்சிகளுக்கு இறுக்கமான அனீலிங் நிலைமைகளைப் பயன்படுத்தி, இறங்கு PCR தனித்துவத்தை மேம்படுத்துகிறது.சுழற்சியானது, மதிப்பிடப்பட்ட Tm ஐ விட தோராயமாக 5℃ அனீலிங் வெப்பநிலையில் தொடங்குகிறது, பின்னர் ஒவ்வொரு சுழற்சியும் 1℃ முதல் 2℃ வரை குறைக்கப்படும் வரை, அனீலிங் வெப்பநிலை Tm 5℃க்குக் குறைவாக இருக்கும்.அதிக ஹோமோலஜி கொண்ட இலக்கு டெம்ப்ளேட் மட்டுமே பெருக்கப்படும்.இந்த தயாரிப்புகள் அடுத்தடுத்த சுழற்சிகளில் தொடர்ந்து விரிவடைந்து, பெருக்கப்பட்ட குறிப்பிடப்படாத தயாரிப்புகளை வெளியேற்றுகின்றன.ஏஎஃப்எல்பி டிஎன்ஏ கைரேகை போன்ற ப்ரைமர் மற்றும் டார்கெட் டெம்ப்ளேட் ஆகியவற்றுக்கு இடையே உள்ள ஹோமோலஜியின் அளவு அறியப்படாத முறைகளுக்கு, இறங்கு PCR பயனுள்ளதாக இருக்கும்.
தொடர்புடைய PCR கருவிகள்
2× PCR ஹீரோTMமிக்ஸ் சிஸ்டம் சாதாரண பிசிஆர் மிக்ஸ் அமைப்பை விட பிசிஆர் இன்ஹிபிட்டர்களுக்கு அதிக சகிப்புத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளது, மேலும் பல்வேறு சிக்கலான டெம்ப்ளேட்களின் பிசிஆர் பெருக்கத்தை எளிதாக சமாளிக்க முடியும்.தனித்துவமான எதிர்வினை அமைப்பு மற்றும் உயர்-செயல்திறன் Taq Hero ஆகியவை PCR எதிர்வினையை அதிக பெருக்க திறன், தனித்தன்மை மற்றும் உணர்திறன் ஆகியவற்றைக் கொண்டிருக்கின்றன.
அதிக பெருக்க திறன்
இது 5'→3' டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் செயல்பாடு மற்றும் 5'→3' எக்ஸோநியூக்லீஸ் செயல்பாடு, 3'→5' எக்ஸோநியூக்லீஸ் செயல்பாடு இல்லாமல் உள்ளது.
ரியல் டைம் PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
குறிப்பிட்ட-உகந்த பஃபர் மற்றும் ஹாட்-ஸ்டார்ட் டாக் என்சைம் ஆகியவை குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கம் மற்றும் ப்ரைமர் டைமர் உருவாவதைத் தடுக்கலாம்
அதிக உணர்திறன்-வார்ப்புருவின் குறைந்த நகல்களைக் கண்டறிய முடியும்
கிட் ஒரு தனித்துவமான Foregene தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ரியாஜென்ட் மற்றும் Foregene HotStar Taq DNA பாலிமரேஸ் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்துகிறது, இது ஒரு தனித்துவமான எதிர்வினை அமைப்புடன் இணைந்து வினையின் பெருக்க திறன் மற்றும் தனித்துவத்தை திறம்பட மேம்படுத்துகிறது.
இடுகை நேரம்: மே-09-2023
