மையக் கோட்பாட்டில், டிஎன்ஏ மற்றும் புரத வெளிப்பாட்டிற்கு இடையே டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் மத்தியஸ்தராக ஆர்என்ஏ உள்ளது என்பது அனைவரும் அறிந்ததே.டிஎன்ஏ கண்டறிதலுடன் ஒப்பிடுகையில், ஆர்என்ஏவைக் கண்டறிதல் உயிரினங்களில் மரபணு வெளிப்பாட்டை மிகவும் புறநிலையாக பிரதிபலிக்கும்.ஆர்என்ஏவை உள்ளடக்கிய சோதனைகளில் பின்வருவன அடங்கும்: qRT-PCR, RNA-Seq, மற்றும் இணைவு மரபணு கண்டறிதல் போன்றவை. ஆர்என்ஏவின் குணாதிசயங்களின் அடிப்படையில் (ஆர்என்ஏவின் சர்க்கரை வளையம் டிஎன்ஏவின் சர்க்கரை வளையத்தை விட ஒரு இலவச ஹைட்ராக்சில் குழுவைக் கொண்டுள்ளது), சுற்றுச்சூழலில் அதிக எண்ணிக்கையிலான ஆர்நேஸ்களுடன், டிஎன்ஏவை விட நிலையற்றது மற்றும் சிதைக்க எளிதானது.ஆர்.என்.ஏ.வின் தரம் நன்றாக இல்லை என்றால், குப்பை உள்ளே, குப்பை வெளியே, பின்னர் சோதனை முடிவுகள் திருப்தியற்றதாக இருக்க வேண்டும், குறிப்பாக துல்லியமற்ற தரவு அல்லது மோசமான மீண்டும் மீண்டும் வெளிப்படும்.எனவே, ஆர்என்ஏ செயலாக்கத்தில் அதிக கவனம் செலுத்தப்பட வேண்டும், மேலும் அடுத்தடுத்த சோதனைத் தரவின் துல்லியம் மற்றும் துல்லியத்தை உறுதிப்படுத்த தரக் கட்டுப்பாட்டின் இணைப்பு மிகவும் முக்கியமானது.

ஆர்என்ஏவின் தரக் கட்டுப்பாட்டிற்கு, பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் பின்வரும் முறைகள் உள்ளன:

• ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமெட்ரி
• அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ்
• சுறுசுறுப்பான உயிரியல் பகுப்பாய்வி
• நிகழ்நேர ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR
• குபிட் ஃப்ளோரசன்ட் சாய முறை

01 ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமெட்ரி

ஆர்என்ஏ இரட்டைப் பிணைப்புகளை இணைத்துள்ளது மற்றும் 260nm அலைநீளத்தில் உறிஞ்சும் உச்சத்தை கொண்டுள்ளது.Lambert-Beer இன் சட்டத்தின்படி, 260nm இல் உள்ள உறிஞ்சுதல் உச்சத்திலிருந்து RNA செறிவைக் கணக்கிடலாம்.கூடுதலாக, 260nm, 280nm மற்றும் 230nm உறிஞ்சுதல் உச்சங்களின் விகிதத்தின்படி RNA இன் தூய்மையையும் நாம் கணக்கிடலாம்.280nm மற்றும் 230nm ஆகியவை முறையே புரதங்கள் மற்றும் சிறிய மூலக்கூறுகளின் உறிஞ்சுதல் உச்சங்களாகும்.தகுதிவாய்ந்த RNA தூய்மையின் A260/A280 மற்றும் A260/A230 ஆகியவற்றின் விகிதம் 2 ஐ விட அதிகமாக இருக்க வேண்டும். 2 க்கும் குறைவாக இருந்தால், RNA மாதிரியில் புரதம் அல்லது சிறிய மூலக்கூறு மாசு உள்ளது மற்றும் மீண்டும் சுத்திகரிக்கப்பட வேண்டும் என்று அர்த்தம்.மாசுபடுத்தும் ஆதாரங்கள், PCR எதிர்வினைகளின் பெருக்கத் திறனைத் தடுப்பது போன்ற கீழ்நிலை சோதனைகளைப் பாதிக்கும், இதன் விளைவாக துல்லியமற்ற அளவு முடிவுகள் ஏற்படும்.ஆர்என்ஏவின் தூய்மையானது அடுத்தடுத்த முடிவுகளில் பெரும் தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது, எனவே ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமெட்ரி பொதுவாக நியூக்ளிக் அமில சோதனைகளில் முதல் படியில் தவிர்க்க முடியாத தரக் கட்டுப்பாட்டு இணைப்பாகும்.

படம் 1. வழக்கமான ஆர்என்ஏ/டிஎன்ஏ உறிஞ்சுதல் நிறமாலை

02 அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ்

தூய்மைக்கு கூடுதலாக, ஆர்என்ஏவின் ஒருமைப்பாடு ஆர்என்ஏவின் தரத்தை மதிப்பிடுவதற்கான முக்கியமான குறிகாட்டிகளில் ஒன்றாகும்.ஆர்என்ஏவின் சிதைவு மாதிரியில் அதிக எண்ணிக்கையிலான குறுகிய துண்டுகளுக்கு வழிவகுக்கும், எனவே குறிப்பு வரிசையால் திறம்பட கண்டறியப்பட்டு மறைக்கப்படும் ஆர்என்ஏ துண்டுகளின் எண்ணிக்கை குறைக்கப்படும்.1% ஆகரோஸ் ஜெல்லில் மொத்த ஆர்என்ஏவின் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் ஆர்என்ஏ ஒருமைப்பாட்டை சரிபார்க்கலாம்.இந்த முறையானது ஜெல்லை நீங்களே கட்டமைக்கலாம் அல்லது ஒருமைப்பாடு சோதனைக்கு முன்னரே தயாரிக்கப்பட்ட E-Gel™ சிஸ்டத்தைப் பயன்படுத்தலாம்.மொத்த ஆர்என்ஏவில் 80% க்கும் அதிகமானவை ரைபோசோமால் ஆர்என்ஏ ஆகும், இதில் பெரும்பாலானவை 28எஸ் மற்றும் 18எஸ் ஆர்ஆர்என்ஏ (பாலூட்டி அமைப்புகளில்) கொண்டது.நல்ல தரமான RNA இரண்டு வெளிப்படையான பிரகாசமான பார்களைக் காண்பிக்கும், அவை முறையே 28S மற்றும் 18S பிரகாசமான பார்கள், 5 Kb மற்றும் 2 Kb, மற்றும் விகிதம் 2:1 க்கு அருகில் இருக்கும்.அது ஒரு பரவலான நிலையில் இருந்தால், ஆர்என்ஏ மாதிரி சிதைந்திருக்கலாம் என்று அர்த்தம், மேலும் ஆர்என்ஏவின் தரத்தை மேலும் சோதிக்க பின்னர் விவரிக்கப்பட்ட முறையைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

படம் 2. அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸில் சிதைந்த (லேன் 2) மற்றும் அப்படியே ஆர்என்ஏ (லேன் 3) ஆகியவற்றின் ஒப்பீடு

03 அஜிலன்ட் பயோஅனாலிசர்

மேலே விவரிக்கப்பட்ட அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் முறைக்கு கூடுதலாக, ஆர்என்ஏவின் ஒருமைப்பாட்டை எளிமையாகவும் விரைவாகவும் கண்டறிய உதவுகிறது, ஆர்என்ஏவின் ஒருமைப்பாட்டைக் கண்டறிய அஜிலன்ட் பயோஅனாலைசரையும் பயன்படுத்தலாம்.ஆர்என்ஏ செறிவு மற்றும் ஒருமைப்பாட்டை மதிப்பிடுவதற்கு மைக்ரோஃப்ளூய்டிக்ஸ், கேபிலரி எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மற்றும் ஃப்ளோரசன்ஸ் ஆகியவற்றின் கலவையைப் பயன்படுத்துகிறது.ஆர்என்ஏ மாதிரியின் சுயவிவரத்தை பகுப்பாய்வு செய்ய உள்ளமைக்கப்பட்ட அல்காரிதத்தைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், அஜிலன்ட் பயோஅனாலைசர் ஒரு குறிப்பு ஆர்என்ஏ ஒருமைப்பாடு மதிப்பு, ஆர்என்ஏ ஒருமைப்பாடு எண் (இனிமேல் RIN என குறிப்பிடப்படுகிறது) [1] கணக்கிட முடியும்.RIN இன் பெரிய மதிப்பு, RNA இன் ஒருமைப்பாடு அதிகமாகும் (1 மிகவும் சிதைந்துள்ளது, 10 மிகவும் முழுமையானது).ஆர்என்ஏ சம்பந்தப்பட்ட சில சோதனைகள் தர மதிப்பீட்டிற்கான அளவுருவாக RIN ஐப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கின்றன.உயர்-செயல்திறன் வரிசைமுறை சோதனைகளை எடுத்துக் கொண்டால் (இனிமேல் NGS என குறிப்பிடப்படுகிறது), தெர்மோ ஃபிஷரின் ஆன்கோமைன் பேனல் தொடரில் உள்ள B செல் மற்றும் T செல் ஆன்டிஜென் ஏற்பிகளைக் கண்டறியப் பயன்படும் Oncomine™ Human Immune Repertoire இன் வழிகாட்டுதல்கள், RIN மதிப்புகளைக் கொண்ட மாதிரிகள் 4 ஐ விட அதிகமாகப் படிக்கலாம்.வெவ்வேறு பேனல்களுக்கு வெவ்வேறு பரிந்துரைக்கப்பட்ட வரம்புகள் உள்ளன, மேலும் அதிக RIN ஆனது மிகவும் பயனுள்ள தரவைக் கொண்டு வரும்.

படம் 3, Oncomine™ Human Immune Repertoire சோதனைகளில், RIN 4 ஐ விட அதிகமான மாதிரிகள் மிகவும் பயனுள்ள வாசிப்புகள் மற்றும் T செல் குளோன்களைக் கண்டறிய முடியும்.【2】

இருப்பினும், RIN மதிப்பும் சில வரம்புகளைக் கொண்டுள்ளது.RIN ஆனது NGS சோதனைத் தரவின் தரத்துடன் அதிக தொடர்பைக் கொண்டிருந்தாலும், FFPE மாதிரிகளுக்கு இது பொருந்தாது.FFPE மாதிரிகள் நீண்ட காலமாக வேதியியல் முறையில் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டு வருகின்றன, மேலும் பிரித்தெடுக்கப்பட்ட RNA பொதுவாக ஒப்பீட்டளவில் குறைந்த RIN மதிப்பைக் கொண்டுள்ளது.இருப்பினும், சோதனையின் பயனுள்ள தரவு திருப்தியற்றதாக இருக்க வேண்டும் என்று இது அர்த்தப்படுத்துவதில்லை.FFPE மாதிரிகளின் தரத்தை துல்லியமாக மதிப்பிட, RIN தவிர வேறு அளவீடுகளைப் பயன்படுத்த வேண்டும்.RIN உடன் கூடுதலாக, Agilent bioanalyzer DV200 மதிப்பை RNA தரத்தின் மதிப்பீட்டு அளவுருவாகவும் கணக்கிட முடியும்.DV200 என்பது RNA மாதிரியில் 200 bp க்கும் அதிகமான துண்டுகளின் விகிதத்தைக் கணக்கிடும் அளவுருவாகும்.DV200 என்பது RIN ஐ விட FFPE மாதிரி தரத்தின் சிறந்த குறிகாட்டியாகும்.FFPE ஆல் பிரித்தெடுக்கப்பட்ட RNA க்கு, இது திறம்பட கண்டறியக்கூடிய மரபணுக்களின் எண்ணிக்கை மற்றும் மரபணுக்களின் பன்முகத்தன்மை ஆகியவற்றுடன் மிக அதிக தொடர்பு உள்ளது [3].DV200 ஆனது FFPE இன் தரக் கண்டறிதலில் உள்ள குறைபாடுகளை ஈடுசெய்ய முடியும் என்றாலும், அஜிலன்ட் பயோஅனாலைசரால் RNA மாதிரிகளில் உள்ள தரச் சிக்கல்கள், மாதிரிகளில் தடுப்பான்கள் உள்ளதா என்பது உட்பட இன்னும் விரிவாக ஆய்வு செய்ய முடியவில்லை.தடுப்பான்கள் கீழ்நிலை சோதனைகளின் பெருக்க செயல்திறனை பாதிக்கலாம் மற்றும் பயனுள்ள தரவுகளின் அளவைக் குறைக்கலாம்.மாதிரியில் தடுப்பான் உள்ளதா என்பதை அறிய, அடுத்து விவரிக்கப்பட்டுள்ள நிகழ்நேர ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR முறையைப் பின்பற்றலாம்.

04 நிகழ்நேர ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR

நிகழ்நேர ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR முறையானது மாதிரியில் உள்ள தடுப்பான்களைக் கண்டறிவது மட்டுமல்லாமல், FFPE மாதிரியில் உள்ள RNA இன் தரத்தையும் துல்லியமாகப் பிரதிபலிக்கும்.அஜிலன்ட் உயிரியல் பகுப்பாய்விகளுடன் ஒப்பிடுகையில், நிகழ்நேர ஒளிரும் அளவு கருவிகள் அவற்றின் பரந்த பயன்பாடு காரணமாக முக்கிய உயிரியல் ஆய்வகங்களில் மிகவும் பிரபலமாக உள்ளன.ஆர்என்ஏ மாதிரிகளின் தரத்தை சோதிக்க, ஜியூஎஸ்பி (பூனை எண். Hs00939627) போன்ற உள் குறிப்பு மரபணுக்களுக்கான ப்ரைமர் ஆய்வுகளை மட்டுமே வாங்க வேண்டும் அல்லது தயாரிக்க வேண்டும்.இந்த ப்ரைமர்கள், ஆய்வுகள் மற்றும் தரநிலைகள் (தெரிந்த செறிவின் மொத்த RNA) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி முழுமையான அளவு சோதனைகளை நடத்துவதன் மூலம், பயனுள்ள RNA துண்டுச் செறிவை RNA தரத்தின் மதிப்பீட்டுத் தரமாகக் கணக்கிடலாம் (செயல்பாட்டு RNA அளவு (FRQ) சுருக்கமாக).ஒரு NGS சோதனையில், RNA மாதிரிகளின் FRQ, பயனுள்ள தரவு அளவோடு மிக அதிக தொடர்பைக் கொண்டிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம்.0.2ng/uL FRQ ஐ விட அதிகமான அனைத்து மாதிரிகளுக்கும், குறைந்தபட்சம் 70% வாசிப்புகள் குறிப்பு வரிசையை திறம்பட உள்ளடக்கும் (படம் 4).

படம் 4, ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவு முறை மூலம் கண்டறியப்பட்ட FRQ மதிப்பு NGS பரிசோதனையில் பெறப்பட்ட பயனுள்ள தரவுகளுடன் மிக அதிக தொடர்பு (R2>0.9) உள்ளது.சிவப்பு கோடு என்பது 0.2 ng/uL (log10 = -0.7) க்கு சமமான FRQ மதிப்பாகும்.【4】

FFPE மாதிரிகளுக்குப் பொருந்துவதுடன், நிகழ்நேர அளவு PCR முறையானது மாதிரிகளில் உள்ள தடுப்பான்களையும் திறம்பட கண்காணிக்க முடியும்.உள் நேர்மறைக் கட்டுப்பாடு (IPC) மற்றும் அதன் மதிப்பீட்டைக் கொண்டு எதிர்வினை அமைப்பில் கண்டறியப்பட வேண்டிய மாதிரியைச் சேர்க்கலாம், பின்னர் Ct மதிப்பைப் பெற ஃப்ளோரசன் அளவைச் செய்யலாம்.மாதிரி இல்லாத எதிர்வினையில் Ct மதிப்பு Ct மதிப்பைக் காட்டிலும் பின்தங்கியிருந்தால், அது மாதிரியில் தடுப்பான் இருப்பதைக் குறிக்கிறது மற்றும் எதிர்வினையின் பெருக்க செயல்திறனைத் தடுக்கிறது.

05 Qubit ஃப்ளோரசன்ட் சாய முறை

க்யூபிட் ஃப்ளோரோமீட்டர் என்பது நியூக்ளிக் அமிலம் செறிவு மற்றும் தூய்மையைக் கண்டறிவதற்கு மிகவும் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் சிறிய சாதனமாகும், இது செயல்பட எளிதானது மற்றும் கிட்டத்தட்ட ஒவ்வொரு மூலக்கூறு உயிரியல் ஆய்வகத்திலும் உள்ளது.இது நியூக்ளிக் அமிலத்தின் செறிவைக் கண்டறிதல் மற்றும் நியூக்ளிக் அமிலம்-பிணைப்பு ஃப்ளோரசன்ட் சாயத்தை (குபிட் கண்டறிதல் ரியாஜென்ட்) மூலம் துல்லியமாகக் கணக்கிடுகிறது.க்யூபிட் அதிக உணர்திறன் மற்றும் தனித்தன்மையைக் கொண்டுள்ளது, மேலும் ஆர்என்ஏவை pg/µL வரை துல்லியமாக அளவிட முடியும்.நியூக்ளிக் அமில செறிவைத் துல்லியமாக அளவிடும் நன்கு அறியப்பட்ட திறனுடன், தெர்மோ ஃபிஷரின் சமீபத்திய புதிய மாடலான க்யூபிட் 4.0, ஆர்என்ஏவின் ஒருமைப்பாட்டையும் கண்டறிய முடியும்.Qubit 4.0′s RNA கண்டறிதல் அமைப்பு (RNA IQ Assay) இரண்டு குறிப்பிட்ட ஃப்ளோரசன்ட் சாயங்களை ஒரே நேரத்தில் கண்டறிவதன் மூலம் RNA இன் ஒருமைப்பாட்டைக் கண்டறிகிறது.இந்த இரண்டு ஃப்ளோரசன்ட் சாயங்களும் முறையே பெரிய துண்டுகள் மற்றும் RNAவின் சிறிய துண்டுகளுடன் பிணைக்க முடியும்.இந்த இரண்டு ஃப்ளோரசன்ட் சாயங்கள் மாதிரியில் உள்ள ஆர்என்ஏவின் பெரிய துண்டுகளின் விகிதத்தைக் குறிக்கின்றன, இதிலிருந்து ஆர்என்ஏ தரத்தைக் குறிக்கும் ஐக்யூ (ஒருமைப்பாடு மற்றும் தரம்) மதிப்பைக் கணக்கிடலாம்.IQ மதிப்பு FFPE மற்றும் FFPE அல்லாத மாதிரிகள் இரண்டிற்கும் பொருந்தும், மேலும் அடுத்தடுத்த வரிசைமுறை தரத்தில் பெரும் தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது.NGS சோதனைகளை உதாரணமாக எடுத்துக் கொண்டால், அயன் டோரண்ட்™ இயங்குதளத்தில் நிகழ்த்தப்பட்ட RNA-Seq சோதனை சோதனைகளில், 4 ஐ விட அதிகமான IQ மதிப்புகளைக் கொண்ட பெரும்பாலான மாதிரிகள் குறைந்தது 50% பயனுள்ள வாசிப்புகளைக் கொண்டிருந்தன (படம் 5).மேற்கூறிய கண்டறிதல் முறைகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​Qubit IQ Assay செயல்படுவதற்கு மிகவும் வசதியானது மற்றும் குறைந்த நேரம் (ஐந்து நிமிடங்களுக்குள்) எடுக்கும், ஆனால் அளவிடப்பட்ட அளவுரு IQ மதிப்பு மற்றும் கீழ்நிலை சோதனைகளின் தரவு தரம் ஆகியவற்றுக்கு இடையே ஒரு பெரிய தொடர்பு உள்ளது.

படம் 5, Qubit RNA IQ மதிப்புக்கும் RNA-Seq இன் வரைபட வாசிப்புகளுக்கும் இடையே ஒரு பெரிய தொடர்பு உள்ளது.【5】

மேலே உள்ள அறிமுகத்தின் மூலம், ஒவ்வொருவருக்கும் வெவ்வேறு RNA தரக் கட்டுப்பாட்டு முறைகள் பற்றிய போதுமான புரிதல் இருப்பதாக நான் நம்புகிறேன்.நடைமுறையில், நீங்கள் தேர்வு செய்யலாம்மாதிரி வகை மற்றும் ஏற்கனவே உள்ள கருவிகளின் படி தொடர்புடைய முறை.ஆர்.என்.ஏ-வின் தரத்தை நன்றாகக் கட்டுப்படுத்துவதன் மூலம் மட்டுமே, மோசமான மாதிரித் தரத்தால் ஏற்படும் அடுத்தடுத்த சோதனைகளின் தோல்வியைத் தவிர்க்க முடியும், இதனால் விலைமதிப்பற்ற நேரம், ஆற்றல் மற்றும் செலவு ஆகியவை சேமிக்கப்படும்.

குறிப்பு தயாரிப்புகள்:

விலங்கு மொத்த ஆர்என்ஏ தனிமைப்படுத்தல் கிட்

செல் மொத்த RNA ஐசோலேஷன் கிட்

குறிப்புகள்

【1】ஷ்ரோடர், ஏ., முல்லர், ஓ., ஸ்டாக்கர், எஸ். மற்றும் பலர்.RIN: ஆர்என்ஏ அளவீடுகளுக்கு ஒருமைப்பாடு மதிப்புகளை வழங்குவதற்கான ஆர்என்ஏ ஒருமைப்பாடு எண்.BMC மூலக்கூறு உயிரியல் 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】ஆன்கோமைன் ஹ்யூமன் இம்யூன் ரெப்பர்டோயர் பயனர் கையேடு (பப். எண். MAN0017438 Rev. C.0).

【3】லியா சி வெஹ்மாஸ், சார்லஸ் இ வூட், பிரையன் என் சோர்லி, கரோல் எல் யாக், கெயில் எம் நெல்சன், சூசன் டி ஹெஸ்டர், ஆர்என்ஏவை மதிப்பிடுவதற்கான மேம்படுத்தப்பட்ட தர அளவீடுகள் ஃபார்மலின்-நிலையான பாரஃபின்-உட்பொதிக்கப்பட்ட திசு மாதிரிகள், 102, ஆகஸ்ட் 20 வயது 357–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/