கண்டறிதலின் தனித்தன்மை
பெரும்பாலான சந்தர்ப்பங்களில், ப்ரைமர் வடிவமைப்பின் நோக்கம் PCR இன் தனித்தன்மையை அதிகப்படுத்துவதாகும்.இது பல மாறிகளின் அதிகமாகவோ அல்லது குறைவாகவோ கணிக்கக்கூடிய செல்வாக்கால் தீர்மானிக்கப்படுகிறது.ஒரு முக்கியமான மாறி ப்ரைமரின் 3′இறுதியில் உள்ள வரிசை.
முக்கியமாக, குறிப்பிட்ட தன்மைக்காக வடிவமைக்கப்பட்ட PCR மதிப்பீடுகள், பரந்த டைனமிக் வரம்பில் அதிக செயல்திறனைப் பராமரிக்க அதிக வாய்ப்புள்ளது, ஏனெனில் மதிப்பீடு குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்க தயாரிப்புகளை உருவாக்காது, அதன் மூலம் PCR ரியாஜெண்டுகளுடன் போட்டியிடுகிறது அல்லது முக்கிய பெருக்க எதிர்வினையைத் தடுக்கிறது.
நிச்சயமாக, சில சந்தர்ப்பங்களில், குறிப்பானது மிக முக்கியமானது அல்ல, எடுத்துக்காட்டாக, நெருங்கிய தொடர்புடைய ஆனால் வெவ்வேறு நோய்க்கிருமிகள், சிறப்பு வடிவமைப்பு, தேர்வுமுறை மற்றும் சரிபார்ப்பு தரநிலைகள் தேவைப்படுவதைக் கணக்கிடுவதே குறிக்கோள்.
உருகும் வளைவு என்பது ஆம்பிளிகான்களின் தனித்தன்மையை மதிப்பிடுவதற்கான ஒரு நிலையான முறையாகும், குறைந்தபட்சம் ஒரு இலக்கை பெருக்க வேண்டுமா.எவ்வாறாயினும், உருகும் வளைவுகள் தவறாக வழிநடத்தும் என்பதை வலியுறுத்த வேண்டும், ஏனெனில், எடுத்துக்காட்டாக, அவை துணை ப்ரைமர்கள் மற்றும் குறைந்த டெம்ப்ளேட் செறிவுகளின் ஒருங்கிணைந்த விளைவுகளால் பாதிக்கப்படலாம்.
P5 |உருகும் வளைவு இரண்டு இலக்கு டிஎன்ஏக்களின் வெவ்வேறு அளவுகளின் இரண்டு கண்டறிதல்களிலிருந்து பெறப்பட்ட டிஎம் மாற்றங்களைக் காட்டுகிறது.
A. அதிக செறிவுகளில் (விளம்பரம்), qPCR அளவீடு முடிந்த பிறகு வெளிப்படையான ப்ரைமர் டைமர் இல்லை.டெம்ப்ளேட் செறிவு 50 பிரதிகளாக (e) குறைவதால், ஒரு குறிப்பிட்ட அல்லாத தயாரிப்பு தோன்றத் தொடங்குகிறது மற்றும் குறைந்த செறிவில் (f) ஒரே தயாரிப்பாக மாறும்.
B. சோதனையானது அனைத்து இலக்கு செறிவுகளிலும் ஒரே டிஎம்எஸ் பதிவு செய்தது, மேலும் குறைந்த செறிவில் (5 பிரதிகள்) கூட வெளிப்படையான ப்ரைமர் டைமர் இல்லை.இந்த இரண்டு கண்டறிதல் முறைகளைப் பயன்படுத்தும் போது, NTC களில் பெருக்க தயாரிப்புகள் எதுவும் கண்டறியப்படவில்லை.
வெவ்வேறு செறிவுகளில் டெம்ப்ளேட் இருக்கும் மாதிரிகளுடன் பெறப்பட்ட கரைப்பு வளைவுகளை P5 காட்டுகிறது.P 5a, இரண்டு குறைந்த செறிவுகளில், உற்பத்தி செய்யப்படும் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்க தயாரிப்புகளின் Tms குறிப்பிட்ட ஆம்பிளிகான்களை விட குறைவாக இருப்பதைக் காட்டுகிறது.
வெளிப்படையாக, குறைந்த செறிவுகளில் இருக்கும் இலக்குகளைக் கண்டறிய இந்த கண்டறிதல் முறையை நம்பத்தகுந்த முறையில் பயன்படுத்த முடியாது.
சுவாரஸ்யமாக, என்டிசிக்கள், அதாவது, டிஎன்ஏ இல்லாத மாதிரிகள், (குறிப்பிடப்படாத) பெருக்க தயாரிப்புகளை பதிவு செய்யவில்லை, இது பின்னணி மரபணு டிஎன்ஏ குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கம்/பாலிமரைசேஷனில் பங்கேற்க முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது.
சில நேரங்களில் இத்தகைய பின்னணி ப்ரைமர்கள் மற்றும் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்தை சரிசெய்ய முடியாது, ஆனால் எந்த டெம்ப்ளேட் செறிவு மற்றும் NTC (P 5b) இல் குறிப்பிடப்படாத பெருக்கம் இல்லாத கண்டறிதல் முறையை வடிவமைக்க இது பெரும்பாலும் சாத்தியமாகும்.
இங்கே, இலக்கு செறிவின் பெருக்கத்தை Cq 35 உடன் பதிவு செய்வது கூட ஒரு குறிப்பிட்ட கரைப்பு வளைவை உருவாக்கும்.இதேபோல், NTC கள் குறிப்பிடப்படாத பெருக்கத்தின் அறிகுறிகளைக் காட்டவில்லை.சில சமயங்களில், கண்டறிதல் நடத்தை தாய் மதுபானத்தைச் சார்ந்து இருக்கலாம், மேலும் குறிப்பிட்ட சில இடையக கலவைகளில் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கம் மட்டுமே கண்டறியப்படுகிறது, இது வெவ்வேறு Mg2+ செறிவுகளுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம்.
கண்டறிதலின் நிலைத்தன்மை
Ta இன் மேம்படுத்தல் என்பது qPCR கண்டறிதலின் அனுபவ சரிபார்ப்பு மற்றும் தேர்வுமுறை செயல்பாட்டில் பயனுள்ள படியாகும்.இது NTC ஐப் பெருக்காமல் மிகக் குறைந்த Cq ஐ உருவாக்கும் வெப்பநிலை (அல்லது வெப்பநிலை வரம்பு) காட்டுவதன் மூலம் ப்ரைமர் தொகுப்பின் வலிமையின் நேரடிக் குறிப்பை வழங்குகிறது.
உணர்திறனில் இரண்டு முதல் நான்கு மடங்கு வேறுபாடு அதிக எம்ஆர்என்ஏ வெளிப்பாடு உள்ளவர்களுக்கு முக்கியமானதாக இருக்காது, ஆனால் கண்டறியும் சோதனைகளுக்கு, இது நேர்மறை மற்றும் தவறான எதிர்மறை முடிவுகளுக்கு இடையிலான வேறுபாட்டைக் குறிக்கலாம்.
qPCR ப்ரைமர்களின் Ta பண்புகள் பெரிதும் மாறுபடலாம்.சில சோதனைகள் மிகவும் வலுவானவை அல்ல, மேலும் அவை ப்ரைமர்களின் உகந்த Ta மதிப்பின் கீழ் செய்யப்படாவிட்டால், அவை விரைவாக சரிந்துவிடும்.
இது முக்கியமானது, ஏனெனில் இந்த வகையான கண்டறிதல் நிஜ உலகில் பெரும்பாலும் சிக்கலாக உள்ளது, மேலும் மாதிரியின் தூய்மை, டிஎன்ஏவின் செறிவு அல்லது பிற டிஎன்ஏவின் இருப்பு ஆகியவை உகந்ததாக இருக்காது.
கூடுதலாக, இலக்கு நகல் எண் பரவலான வரம்பில் மாறுபடலாம், மேலும் வினைப்பொருட்கள், பிளாஸ்டிக் பாத்திரங்கள் அல்லது கருவிகள் சோதனையை அமைக்கும் போது பயன்படுத்தப்பட்டவற்றிலிருந்து வேறுபட்டிருக்கலாம்.
P6|வெப்பநிலை சாய்வு PCR கண்டறிதலின் வெவ்வேறு வலிமையைக் காட்டுகிறது.
A. மனித மூளை ஆர்என்ஏவில் இருந்து தயாரிக்கப்பட்ட சிடிஎன்ஏவில் பிசிஆர் செய்ய பயோலின் சென்சிஃபாஸ்ட் எஸ்ஒய்பிஆர் மாஸ்டர்மிக்ஸ் (பட்டியல் எண் BIO-98050) பயன்படுத்தவும்.
B. Apalene இன் பெருக்க வரைபடம் மற்றும் கரைப்பு வளைவைப் பதிவு செய்ய Bio-Rad இன் CFX qPCR கருவியைப் பயன்படுத்தவும் (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. ACSBG1 இன் பெருக்க வரைபடம் மற்றும் உருகும் வளைவு (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. GFAP இன் பெருக்க வரைபடம் மற்றும் கரைப்பு வளைவு (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACTCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs வெவ்வேறு அனீலிங் வெப்பநிலைகளில் பதிவுசெய்யப்பட்டது, 7C வெப்பநிலை சாய்வின் கீழ் பதிவு செய்யப்பட்ட Cq இன் வேறுபாட்டைக் காட்டுகிறது.
P 6 விரும்பத்தகாத சோதனையின் ஒரு பொதுவான முடிவைக் காட்டுகிறது, அங்கு qPCR ஆனது 59C மற்றும் 67C (P 6a) இடையே சாய்வு Tas ஐப் பயன்படுத்தி, மூன்று மனித மூளை சார்ந்த மரபணுக்களுக்கான ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது.
ஓபலின் ப்ரைமர்கள் இலட்சியத்திலிருந்து வெகு தொலைவில் இருப்பதை பெருக்க வரைபடத்திலிருந்து காணலாம், ஏனெனில் அவற்றின் உகந்த Ta வரம்பு மிகவும் குறுகியது (படம் 6b), அதாவது, Cqs பரவலாக சிதறடிக்கப்படுகின்றன, இதன் விளைவாக Cqs அவற்றின் உகந்த Cqs குறைவாக ஒப்பிடப்படுகிறது.
இந்த கண்டறிதல் முறை நிலையற்றது மற்றும் துணைப் பெருக்கத்திற்கு வழிவகுக்கும்.எனவே, இந்த ஜோடி ப்ரைமர்களை மறுவடிவமைப்பு செய்ய வேண்டும்.கூடுதலாக, உருகும் வளைவு பகுப்பாய்வு (இன்செட்) இந்த கண்டறிதல் முறையின் தனித்தன்மையும் சிக்கலாக இருக்கலாம் என்பதைக் காட்டுகிறது, ஏனெனில் ஒவ்வொரு Ta இன் உருகும் வளைவும் வேறுபட்டது.
P 6c இல் காட்டப்பட்டுள்ள ACSBG1 கண்டறிதல் முறையானது மேலே உள்ள Opalin கண்டறிதல் முறையை விட மிகவும் வலுவானது, ஆனால் அது இன்னும் இலட்சியத்திலிருந்து வெகு தொலைவில் உள்ளது, மேலும் இது மேம்படுத்தப்படலாம்.
எவ்வாறாயினும், வலிமை மற்றும் தனித்தன்மைக்கு இடையே அவசியமான தொடர்பு இல்லை என்பதை நாங்கள் வலியுறுத்துகிறோம், ஏனெனில் இந்த கண்டறிதல் முறையால் உருவாக்கப்பட்ட கரைப்பு வளைவு அனைத்து டாஸ்களிலும் (இன்செட்) ஒரே உச்ச மதிப்பைக் காட்டுகிறது.
மறுபுறம், P 6d இல் காட்டப்பட்டுள்ள GFAP சோதனையைப் போலவே, வலிமையான சோதனை மிகவும் சகிப்புத்தன்மை வாய்ந்தது, பரந்த அளவிலான Tas இல் ஒத்த Cq களை உருவாக்குகிறது.
அதே 8 டிகிரி செல்சியஸ் வரம்பில் பெறப்பட்ட Cqs இன் வேறுபாடு 1 க்கும் குறைவாக உள்ளது, மேலும் கரைப்பு வளைவு (இன்செட்) இந்த வெப்பநிலை வரம்பில் கண்டறிதல் பண்புகளை உறுதிப்படுத்துகிறது.கணக்கிடப்பட்ட Tas மற்றும் உண்மையான Ta வரம்பு மிகவும் வேறுபட்டதாக இருக்கலாம் என்பது குறிப்பிடத்தக்கது.
திறமையான ப்ரைமர்களை வடிவமைக்க ஆராய்ச்சியாளர்களுக்கு உதவும் வகையில் வடிவமைக்கப்பட்ட பல வழிகாட்டுதல்கள் உள்ளன, அவற்றில் பெரும்பாலானவை நீண்டகாலமாக நிறுவப்பட்ட விதிகளை அடிப்படையாகக் கொண்டவை மற்றும் ப்ரைமர்களின் 3′இறுதியில் அதிக கவனம் செலுத்தப்பட்டுள்ளது.3' முடிவில் ஒரு G அல்லது C மற்றும் இரண்டு G அல்லது C அடிப்படைகள் (GC clamp) சேர்க்க பரிந்துரைக்கப்படுகிறது, ஆனால் கடைசி 5 தளங்களில் இரண்டிற்கு மேல் இல்லை.
நடைமுறையில், இந்த விதிகள் ஆராய்ச்சியாளர்களுக்கு வழிகாட்ட முடியும், ஆனால் அவை எல்லா சூழ்நிலைகளிலும் சரியாக இருக்க வேண்டிய அவசியமில்லை.
P7 |ப்ரைமரின் 3′இறுதியானது குறிப்பிட்ட தன்மை அல்லது செயல்திறனில் சிறிதளவு தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது.
A. மனித HIF-1α (NM_181054.2) மரபணுவுக்கான ப்ரைமர்களின் நிலை.
B. ஆறு சோதனைப் பொருட்களைப் பெருக்க அஜிலன்ட் ப்ரில்லியன்ட் III SYBR பச்சை தாய் மதுபானம் (பூனை எண். 600882) பயன்படுத்தவும்.
C. பயோ-ராடின் CFX qPCR கருவி மற்றும் 3′end ப்ரைமர்களால் பதிவுசெய்யப்பட்ட பெருக்க வரைபடம் மற்றும் உருகும் வளைவு.NTCகள் சிவப்பு நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன.
D. ஒவ்வொரு சோதனைப் பொருளின் Cqs பதிவு
எடுத்துக்காட்டாக, P 7 இல் உள்ள முடிவு 3′இறுதி விதிக்கு முரணானது.அனைத்து வடிவமைப்புகளும் அடிப்படையில் ஒரே மாதிரியான முடிவுகளைத் தருகின்றன, இரண்டு ப்ரைமர் சேர்க்கைகள் மட்டுமே NTC இல் குறிப்பிடப்படாத பெருக்கத்திற்கு வழிவகுக்கும்.
இருப்பினும், GC கிளிப்பின் விளைவை எங்களால் ஆதரிக்க முடியாது, ஏனெனில் இந்த விஷயத்தில், அதிகபட்சம் 30 அடிப்படைகளாக A அல்லது T ஐப் பயன்படுத்துவது குறிப்பிட்ட தன்மையைக் குறைக்காது.
சோதனை C, GGCC இல் F ப்ரைமர் முடிவடைகிறது, NTC களில் Cqs பதிவு செய்யப்பட்டது, இது 30-இறுதியில் இந்தத் தொடர்களைத் தவிர்க்க விரும்பலாம் என்பதைக் குறிக்கிறது.ப்ரைமர் ஜோடியின் சிறந்த 3′இறுதி வரிசையைத் தீர்மானிப்பதற்கான ஒரே வழி, சில கேண்டிடேட் ப்ரைமர்களை சோதனை ரீதியாக மதிப்பீடு செய்வதே என்பதை நாங்கள் வலியுறுத்துகிறோம்.
பெருக்க திறன்
முக்கியமாக, குறிப்பிடப்படாத PCR கண்டறிதல் ஒருபோதும் குறிப்பிட்டதாக மாற முடியாது என்றாலும், நொதி, தாய் மதுபானம், சேர்க்கைகள் மற்றும் சைக்கிள் ஓட்டுதல் நிலைமைகளை மாற்றுவதன் மூலம் பெருக்க செயல்திறனை பல வழிகளில் சரிசெய்யலாம் மற்றும் அதிகரிக்கலாம்.
PCR கண்டறிதலின் செயல்திறனை மதிப்பிடுவதற்கு, இலக்கு நியூக்ளிக் அமிலத்தின் 10 அல்லது 5 மடங்கு சீரியல் நீர்த்தலைப் பயன்படுத்துவது சிறந்தது, அதாவது "நிலையான வளைவு முறை".
நிலையான வளைவை உருவாக்க PCR ஆம்பிளிகான்கள் அல்லது செயற்கை டிஎன்ஏ இலக்குகள் பயன்படுத்தப்பட்டால், இந்த இலக்குகளின் தொடர் நீர்த்தங்கள் நிலையான அளவு பின்னணி டிஎன்ஏவுடன் (ஜீனோமிக் டிஎன்ஏ போன்றவை) கலக்கப்பட வேண்டும்.
P8 |PCR இன் செயல்திறனை மதிப்பிடுவதற்கான நீர்த்த வளைவு.
A. PCR மற்றும் உருகும் வளைவு நிலைகளுக்கு HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA மற்றும் R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC மற்றும் Agilent's Brilliant III SYBR பசுமை மாஸ்டர்மிக்ஸ் (பட்டியல் எண் 600882) க்கான ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தவும்.
B. 100 ng ஆர்என்ஏ தலைகீழ் படியெடுக்கப்பட்டது, 2 முறை நீர்த்தப்பட்டது, மேலும் தொடர்ச்சியாக நீர்த்தப்பட்ட சிடிஎன்ஏ மாதிரிகள் 5 முறை 1 என்ஜி மனித மரபணு டிஎன்ஏவில் நீர்த்தப்பட்டன.உருகும் வளைவு இன்செட்டில் காட்டப்பட்டுள்ளது.
C. இரண்டாவது சிடிஎன்ஏ மாதிரிக்கு ஆர்டி எதிர்வினை, நீர்த்தல் மற்றும் தொடர் நீர்த்தல் ஆகியவை மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்டன, முடிவுகள் ஒரே மாதிரியாக இருந்தன.
P 8 இரண்டு நிலையான வளைவுகளைக் காட்டுகிறது, இரண்டு வெவ்வேறு சிடிஎன்ஏ மாதிரிகளில் ஒரே கண்டறிதல் முறையைப் பயன்படுத்துகிறது, இதன் விளைவாக அதே செயல்திறன், சுமார் 100%, மேலும் R2 மதிப்பும் ஒத்ததாக இருக்கும், அதாவது, சோதனை தரவு மற்றும் பின்னடைவு வரி அல்லது தரவு பட்டம் ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான பொருத்தத்தின் அளவு.
இரண்டு நிலையான வளைவுகள் ஒப்பிடத்தக்கவை, ஆனால் சரியாக இல்லை.இலக்கை துல்லியமாக அளவிடுவதே நோக்கமாக இருந்தால், நிச்சயமற்ற தன்மையை விளக்காமல் நகல் எண் கணக்கீட்டை வழங்குவது ஏற்றுக்கொள்ள முடியாதது என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும்.
P9 |நிலையான வளைவைப் பயன்படுத்தி அளவிடுதலுடன் தொடர்புடைய அளவீட்டு நிச்சயமற்ற தன்மை.
A. PCR மற்றும் உருகும் வளைவு நிலைகளைச் செயல்படுத்த GAPDH (NM_002046)க்கான ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தவும்.F: ACAGTTGCCATGTAGACC மற்றும் R: TAACTGGTTGAGCACAGG மற்றும் பயோலின் சென்சிஃபாஸ்ட் SYBR மாஸ்டர்மிக்ஸ் (பட்டியல் எண் BIO-98050).
B. பெருக்க விளக்கப்படம், உருகும் வளைவு மற்றும் நிலையான வளைவு ஆகியவை Bio-Rad இன் CFX qPCR கருவியுடன் பதிவு செய்யப்பட்டுள்ளன.
C. நிலையான வளைவு வரைபடம் மற்றும் 95% நம்பிக்கை இடைவெளி (CI).
D. நீர்த்த வளைவிலிருந்து பெறப்பட்ட மூன்று Cq மதிப்புகளின் நகல் எண் மற்றும் 95% நம்பிக்கை இடைவெளி.
P 9, ஒரு உகந்த சோதனைக்கு, ஒரு நிலையான வளைவின் உள்ளார்ந்த மாறுபாடு தோராயமாக 2 மடங்கு (95% நம்பிக்கை இடைவெளி, குறைந்தபட்சம் முதல் அதிகபட்சம்) ஆகும், இது எதிர்பார்க்கப்படக்கூடிய சிறிய மாறுபாடுகளாக இருக்கலாம்.
தொடர்புடைய தயாரிப்பு:
இடுகை நேரம்: செப்-30-2021
