நிகழ்நேர PCR, அளவு PCR அல்லது qPCR என்றும் அறியப்படுகிறது, இது PCR பெருக்க தயாரிப்புகளின் நிகழ்நேர கண்காணிப்பு மற்றும் பகுப்பாய்வுக்கான ஒரு முறையாகும்.
அளவு PCR ஆனது எளிமையான செயல்பாடு, வேகமான மற்றும் வசதியான, அதிக உணர்திறன், நல்ல மறுநிகழ்வு மற்றும் குறைந்த மாசுபாடு ஆகியவற்றின் நன்மைகளைக் கொண்டிருப்பதால், இது மருத்துவ பரிசோதனை, மருந்து செயல்திறன் மதிப்பீடு, மரபணு வெளிப்பாடு ஆராய்ச்சி, டிரான்ஸ்ஜெனிக் ஆராய்ச்சி, மரபணு கண்டறிதல், நோய்க்கிருமி கண்டறிதல், விலங்கு மற்றும் தாவர கண்டறிதல் ஆகியவற்றில் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது., உணவு சோதனை மற்றும் பிற துறைகள்.
எனவே, நீங்கள் வாழ்க்கை அறிவியலில் அடிப்படை ஆராய்ச்சியில் ஈடுபட்டிருந்தாலும், அல்லது மருந்து நிறுவனங்கள், கால்நடை வளர்ப்பு நிறுவனங்கள், உணவு நிறுவனங்கள் அல்லது நுழைவு-வெளியேறும் ஆய்வு மற்றும் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட பணியகங்கள், சுற்றுச்சூழல் கண்காணிப்பு துறைகள், மருத்துவமனைகள் மற்றும் பிற பிரிவுகளின் ஊழியர்களாக இருந்தாலும், நீங்கள் அதிகமாகவோ அல்லது குறைவாகவோ வெளிப்படுவீர்கள் அல்லது அளவு PCR அறிவை நீங்கள் அறிந்திருக்க வேண்டும்.

ரியல் டைம் பிசிஆர் கொள்கை

ரியல் டைம் பிசிஆர் என்பது பிசிஆர் எதிர்வினை அமைப்பில் ஃப்ளோரசன்ட் பொருட்கள் சேர்க்கப்படும் ஒரு முறையாகும், மேலும் பிசிஆர் எதிர்வினையின் செயல்பாட்டில் ஒளிரும் சமிக்ஞை தீவிரம் ஒரு அளவு பிசிஆர் கருவியால் நிகழ்நேரத்தில் கண்காணிக்கப்படுகிறது, இறுதியாக சோதனை தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டு செயலாக்கப்படுகிறது.

【பெருக்க வளைவு】PCR இன் மாறும் செயல்முறையை விவரிக்கும் வளைவு ஆகும்.PCR இன் பெருக்க வளைவு உண்மையில் ஒரு நிலையான அதிவேக வளைவு அல்ல, ஆனால் ஒரு சிக்மாய்டு வளைவு.

[பெருக்க வளைவின் இயங்குதளம்]PCR சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை அதிகரிப்பு, டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் செயலிழக்கச் செய்தல், டிஎன்டிபிகள் மற்றும் ப்ரைமர்கள் குறைதல் மற்றும் பைரோபாஸ்பேட் வினையின் மூலம் தொகுப்பு வினையைத் தடுப்பது போன்றவற்றால், பிசிஆர் எப்போதும் அதிவேகமாக விரிவடையாது., மற்றும் இறுதியில் ஒரு பீடபூமிக்குள் நுழையும்.

[பெருக்க வளைவின் அதிவேக வளர்ச்சிப் பகுதி]பீடபூமி கட்டம் பெரிதும் மாறுபடும் என்றாலும், பெருக்க வளைவின் அதிவேக வளர்ச்சிப் பகுதியின் ஒரு குறிப்பிட்ட பகுதியில், மீண்டும் மீண்டும் நிகழ்கிறது, இது PCR இன் அளவு பகுப்பாய்வுக்கு மிகவும் முக்கியமானது.

[வாசல் மதிப்பு மற்றும் Ct மதிப்பு]ஃப்ளோரசன்ஸ் கண்டறிதலின் வரம்பு மதிப்பை பெருக்க வளைவின் அதிவேக வளர்ச்சிப் பகுதியில் பொருத்தமான நிலையில் அமைத்துள்ளோம், அதாவது த்ரெஷோல்ட் மதிப்பு (த்ரெஷோல்ட்).வாசல் மதிப்பு மற்றும் பெருக்க வளைவின் குறுக்குவெட்டு என்பது Ct மதிப்பு, அதாவது, Ct மதிப்பு என்பது வாசல் மதிப்பை அடையும் போது சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையை (Threshold Cycle) குறிக்கிறது.

கீழே உள்ள வரைபடம் வாசல் கோடு மற்றும் பெருக்க வளைவு, வாசல் மற்றும் Ct மதிப்பு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பை தெளிவாகக் காட்டுகிறது.

【எப்படி அளவிடுவது?】

ஆரம்ப வார்ப்புருக்களின் எண்ணிக்கையின் மடக்கையுடன் Ct மதிப்பு ஒரு தலைகீழ் நேரியல் உறவைக் கொண்டுள்ளது என்று கணிதக் கோட்பாட்டின் மூலம் நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது.ரியல் டைம் பிசிஆர் பிசிஆர் பெருக்க தயாரிப்புகளை நிகழ்நேரத்தில் கண்காணித்து, அதிவேக பெருக்க கட்டத்தில் அவற்றை அளவிடுகிறது.

PCR இன் ஒவ்வொரு சுழற்சிக்கும், DNA அதிவேகமாக 2 மடங்கு அதிகரித்து, விரைவில் ஒரு பீடபூமியை அடைந்தது.

டிஎன்ஏ தொடங்கும் அளவு ஏ என்று வைத்துக்கொள்வோம்₀ , n சுழற்சிகளுக்குப் பிறகு, டிஎன்ஏ தயாரிப்பின் கோட்பாட்டு அளவு பின்வருமாறு வெளிப்படுத்தப்படலாம்:

A _n =A ₀ × 2ⁿ

பின்னர், ஆரம்ப டிஎன்ஏ அளவு A 0 ஆக இருந்தால், பெருக்கப்பட்ட பொருளின் அளவு விரைவில் கண்டறிதல் மதிப்பை அடையும் An , மற்றும் An ஐ அடையும் போது ஏற்படும் சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை Ct மதிப்பாகும்.அதாவது, ஆரம்ப டிஎன்ஏ அளவு A 0 அதிகமாக இருந்தால், முந்தைய பெருக்க வளைவு உச்சத்தை அடைகிறது, அதற்கேற்ப தேவையான எண்ணிக்கையிலான சுழற்சிகள் n சிறியதாக இருக்கும்.

அறியப்பட்ட செறிவின் தரநிலையின் சாய்வு நீர்த்துப்போகச் செய்து, நிகழ்நேர PCRக்கான டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்துகிறோம், மேலும் டிஎன்ஏ அளவை அதிகமாக இருந்து குறைவாகத் தொடங்கும் வரிசையில் சம இடைவெளியில் பெருக்க வளைவுகளின் தொடர் பெறப்படும்.Ct மதிப்புக்கும் தொடக்க வார்ப்புருக்களின் எண்ணிக்கையின் மடக்கைக்கும் இடையிலான நேரியல் உறவின் படி, a[நிலையான வளைவு] உருவாக்க முடியும்.

மாதிரியின் Ct மதிப்பை அறியப்படாத செறிவுடன் நிலையான வளைவில் மாற்றுவதன் மூலம், அறியப்படாத செறிவு கொண்ட மாதிரியின் ஆரம்ப டெம்ப்ளேட் அளவைப் பெறலாம், இது ரியல் டைம் PCR இன் அளவுக் கொள்கையாகும்.

ரியல் டைம் பிசிஆர் கண்டறிதல் முறை

எதிர்வினை அமைப்பில் உள்ள ஒளிரும் தீவிரத்தைக் கண்டறிவதன் மூலம் ரியல் டைம் பிசிஆர் பிசிஆர் பெருக்க தயாரிப்புகளைக் கண்டறிகிறது.

ஃப்ளோரசன்ட் சாயம் உட்பொதிக்கும் முறையின் கொள்கை】

ஃப்ளோரசன்ட் சாயங்கள், டிபி கிரீன் ® போன்றவை, பிசிஆர் அமைப்புகளில் இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏவுடன் பிணைக்கப்படலாம் மற்றும் பிணைப்பின் போது ஒளிரும்.

பிசிஆர் சுழற்சிகளின் அதிகரிப்புடன் எதிர்வினை அமைப்பில் ஒளிரும் தீவிரம் அதிவேகமாக அதிகரித்தது.ஃப்ளோரசன்ஸின் தீவிரத்தைக் கண்டறிவதன் மூலம், எதிர்வினை அமைப்பில் டிஎன்ஏ பெருக்கத்தின் அளவை நிகழ்நேரத்தில் கண்காணிக்க முடியும், பின்னர் மாதிரியில் உள்ள தொடக்க டெம்ப்ளேட்டின் அளவை தலைகீழாக மதிப்பிடலாம்.

【ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வு முறையின் கொள்கை】

ஒளிரும் ஆய்வுநியூக்ளிக் அமில வரிசையானது 5′ முடிவில் ஒரு ஒளிரும் குழுவும் 3′ இறுதியில் ஒரு தணிக்கும் குழுவும் உள்ளது, இது குறிப்பாக டெம்ப்ளேட்டுடன் பிணைக்க முடியும்.ஆய்வு அப்படியே இருக்கும் போது, ​​ஃப்ளோரோஃபோர் மூலம் வெளிப்படும் ஃப்ளோரசன்ஸ் தணிக்கும் குழுவால் தணிக்கப்படுகிறது மற்றும் ஒளிர முடியாது.ஆய்வு சிதைந்தால், ஒளிரும் பொருள் பிரிந்து ஒளிரும் தன்மையை வெளியிடும்.

பிசிஆர் எதிர்வினை தீர்வுக்கு ஒரு ஒளிரும் ஆய்வு சேர்க்கப்படுகிறது.அனீலிங் செயல்பாட்டின் போது, ​​ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வு டெம்ப்ளேட்டின் குறிப்பிட்ட நிலைக்கு பிணைக்கப்படும்.நீட்டிப்பு செயல்பாட்டின் போது, ​​PCR நொதியின் 5′→3′ எக்ஸோநியூக்லீஸ் செயல்பாடு டெம்ப்ளேட்டுடன் கலப்பின ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வை சிதைக்க முடியும், மேலும் ஒளிரும் பொருள் ஃப்ளோரசன்ஸை வெளியிட பிரிக்கப்படுகிறது.எதிர்வினை அமைப்பில் ஆய்வின் ஒளிரும் தீவிரத்தைக் கண்டறிவதன் மூலம், PCR தயாரிப்பின் பெருக்க அளவைக் கண்காணிக்கும் நோக்கத்தை அடைய முடியும்.

【ஃப்ளோரசன்ஸ் கண்டறிதல் முறையின் தேர்வு】

உயர் ஹோமோலஜியுடன் வரிசைகளை வேறுபடுத்தவும் மற்றும் SNP தட்டச்சு பகுப்பாய்வு போன்ற மல்டிபிளக்ஸ் PCR கண்டறிதலைச் செய்யவும் இது பயன்படுத்தப்பட்டால், ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வு முறை ஈடுசெய்ய முடியாதது.
மற்ற ரியல் டைம் பிசிஆர் சோதனைகளுக்கு, எளிய, எளிதான மற்றும் குறைந்த விலை ஃப்ளோரசன்ட் சிமேரா முறையைப் பயன்படுத்தலாம்.

probesவலுவான விவரக்குறிப்பு, மல்டிபிளக்ஸ் PCR திறன் கொண்டது

குறைபாடு

பெருக்கத்திற்கான உயர் குறிப்பிட்ட தேவைகள்;

மல்டிபிளக்ஸ் பிசிஆர் செய்ய முடியாது குறிப்பிட்ட ஆய்வுகளை வடிவமைக்க வேண்டும், அதிக விலை;

சில நேரங்களில் ஆய்வு வடிவமைப்பு கடினமாக உள்ளது

தொடர்புடைய தயாரிப்புகள்: