தொடக்கப் பொருள்: ஆர்.என்.ஏ
குவாண்டிடேட்டிவ் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் பிசிஆர் (ஆர்டி-க்யூபிசிஆர்) என்பது பிசிஆர் சோதனைகளில் ஆர்என்ஏவை தொடக்கப் பொருளாகப் பயன்படுத்திப் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு சோதனை முறையாகும்.இந்த முறையில், மொத்த ஆர்என்ஏ அல்லது மெசஞ்சர் ஆர்என்ஏ (எம்ஆர்என்ஏ) முதலில் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் மூலம் நிரப்பு டிஎன்ஏ (சிடிஎன்ஏ) ஆக மாற்றப்படுகிறது.பின்னர், cDNA ஐ டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தி qPCR எதிர்வினை செய்யப்பட்டது.மரபணு வெளிப்பாடு பகுப்பாய்வு, RNA குறுக்கீடு சரிபார்ப்பு, மைக்ரோஅரே சரிபார்ப்பு, நோய்க்கிருமி கண்டறிதல், மரபணு சோதனை மற்றும் நோய் ஆராய்ச்சி உள்ளிட்ட பல்வேறு மூலக்கூறு உயிரியல் பயன்பாடுகளில் RT-qPCR பயன்படுத்தப்படுகிறது.
RT-qPCR க்கான ஒரு-படி மற்றும் இரண்டு-படி முறைகள்
RT-qPCR ஒரு-படி அல்லது இரண்டு-படி முறை மூலம் நிறைவேற்றப்படலாம்.ஒரு-படி RT-qPCR ஆனது ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் பிசிஆர் பெருக்கத்தை ஒருங்கிணைக்கிறது, இது ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் மற்றும் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் ஆகியவை ஒரே குழாயில் அதே தாங்கல் நிலைமைகளின் கீழ் எதிர்வினையை முடிக்க அனுமதிக்கிறது.ஒரு-படி RT-qPCRக்கு வரிசை-குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள் மட்டுமே தேவை.இரண்டு-படி RT-qPCR இல், வெவ்வேறு உகந்த பஃபர்கள், எதிர்வினை நிலைகள் மற்றும் முதன்மை வடிவமைப்பு உத்திகளைப் பயன்படுத்தி, இரண்டு குழாய்களில் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் PCR பெருக்கம் செய்யப்படுகிறது.
நன்மை | பாதகம் | |
ஒரு படி | இரண்டு எதிர்வினைகளும் ஒரு குழாயில் செய்யப்படுவதால், இந்த முறை குறைவான சோதனைப் பிழையைக் கொண்டுள்ளது
குறைவான குழாய் பதிக்கும் படிகள் மாசுபாட்டின் அபாயத்தைக் குறைக்கின்றன
உயர்-செயல்திறன் பெருக்கம்/ஸ்கிரீனிங்கிற்கு ஏற்றது, வேகமானது மற்றும் மீண்டும் உருவாக்கக்கூடியது | இரண்டு-படி எதிர்வினைகளை தனித்தனியாக மேம்படுத்த முடியாது
இரண்டு-படி எதிர்வினையை இணைப்பதன் மூலம் எதிர்வினை நிலைமைகள் சமரசம் செய்யப்படுவதால், உணர்திறன் இரண்டு-படி முறையைப் போல நன்றாக இல்லை
ஒரு மாதிரி மூலம் கண்டறியப்பட்ட இலக்குகளின் எண்ணிக்கை சிறியது |
இரண்டு படிகள் | நிலையான cDNA நூலகங்களை உருவாக்கும் திறன் நீண்ட காலத்திற்கு சேமிக்கப்பட்டு பல எதிர்வினைகளில் பயன்படுத்தப்படுகிறது
பல cDNA நூலகங்கள் தேவையில்லாமல் ஒரே cDNA நூலகத்திலிருந்து இலக்கு மரபணுக்கள் மற்றும் குறிப்பு மரபணுக்கள் பெருக்கப்படலாம்.
ஒற்றை எதிர்வினை ஓட்டங்களை மேம்படுத்துவதை செயல்படுத்தும் எதிர்வினை இடையகங்கள் மற்றும் எதிர்வினை நிலைகள்
தூண்டுதல் நிலைமைகளின் நெகிழ்வான தேர்வு | பல குழாய்களைப் பயன்படுத்துதல் மற்றும் அதிக குழாய் பதிக்கும் படிகள் டிஎன்ஏ மாசுபாட்டின் அபாயத்தை அதிகரிக்கிறது, மற்றும் நேரத்தை எடுத்துக்கொள்ளும்.
ஒரு-படி முறையை விட அதிக தேர்வுமுறை தேவைப்படுகிறது |
தொடர்புடைய தயாரிப்புகள்:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (ஒரு படி)-SYBR பசுமை I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (ஒரு படி)-தக்மான்
முதல் ஸ்ட்ராண்ட் சிடிஎன்ஏ தொகுப்புக்கான ஆர்டி ஈஸி I மாஸ்டர் பிரீமிக்ஸ்
ரியல் டைம் PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
மொத்த RNA மற்றும் mRNA தேர்வு
RT-qPCR பரிசோதனையை வடிவமைக்கும் போது, மொத்த RNA அல்லது சுத்திகரிக்கப்பட்ட mRNA ஐ ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கான டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்த வேண்டுமா என்பதைத் தீர்மானிக்க வேண்டியது அவசியம்.எம்ஆர்என்ஏ சற்று அதிக உணர்திறனை வழங்க முடியும் என்றாலும், மொத்த ஆர்என்ஏ இன்னும் அடிக்கடி பயன்படுத்தப்படுகிறது.இதற்குக் காரணம், எம்ஆர்என்ஏவை விட மொத்த ஆர்என்ஏ ஒரு தொடக்கப் பொருளாக மிக முக்கியமான நன்மையைக் கொண்டுள்ளது.முதலாவதாக, செயல்முறைக்கு குறைவான சுத்திகரிப்பு படிகள் தேவைப்படுகின்றன, இது டெம்ப்ளேட்டின் சிறந்த அளவு மீட்பு மற்றும் செல் எண்களைத் தொடங்கும் முடிவுகளை சிறப்பாக இயல்பாக்குவதை உறுதி செய்கிறது.இரண்டாவதாக, இது mRNA செறிவூட்டல் படியைத் தவிர்க்கிறது, இது வெவ்வேறு mRNAகளின் வெவ்வேறு மீட்டெடுப்புகளின் காரணமாக வளைந்த முடிவுகளின் சாத்தியத்தைத் தவிர்க்கலாம்.ஒட்டுமொத்தமாக, பெரும்பாலான பயன்பாடுகளில், கண்டறிதலின் முழுமையான உணர்திறனை விட இலக்கு மரபணுவின் ஒப்பீட்டு அளவீடு மிகவும் முக்கியமானது என்பதால், பெரும்பாலான சந்தர்ப்பங்களில் மொத்த RNA மிகவும் பொருத்தமானது.
தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ப்ரைமர்
இரண்டு-படி முறையில், சிடிஎன்ஏ வினையை முதன்மைப்படுத்த மூன்று வெவ்வேறு முறைகளைப் பயன்படுத்தலாம்: ஒலிகோ(டிடி) ப்ரைமர்கள், ரேண்டம் ப்ரைமர்கள் அல்லது வரிசை-குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள்.பொதுவாக, ஒலிகோ(dT) ப்ரைமர்கள் மற்றும் ரேண்டம் ப்ரைமர்கள் இணைந்து பயன்படுத்தப்படுகின்றன.இந்த ப்ரைமர்கள் டெம்ப்ளேட் mRNA இழையுடன் இணைக்கப்பட்டு, தொகுப்புக்கான தொடக்கப் புள்ளியுடன் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸை வழங்குகிறது.
ப்ரைமர் தேர்வு | கட்டமைப்பு மற்றும் செயல்பாடு | நன்மை | பாதகம் |
ஒலிகோ(dT) ப்ரைமர் (அல்லது நங்கூரமிட்ட ஒலிகோ(dT) ப்ரைமர்) | எம்ஆர்என்ஏவின் பாலி(ஏ) வால் பகுதியில் உள்ள தைமின் எச்சங்களுக்கு நீட்டிக்கப்பட்ட அனீலிங்;ஆங்கர் ஒலிகோ(dT) ப்ரைமரில் 3′ இறுதியில் (நங்கூரம் தளம்) G, C அல்லது A உள்ளது | பாலி(A)-டெயில் எம்ஆர்என்ஏவில் இருந்து முழு நீள சிடிஎன்ஏவின் தொகுப்பு
குறைவான தொடக்கப் பொருள் கிடைக்கும் போது பொருந்தும்
ஒலிகோ(dT) ப்ரைமர் எம்ஆர்என்ஏவின் 5′ பாலி(ஏ) வாலுடன் பிணைக்கப்படுவதை ஆங்கரிங் தளம் உறுதி செய்கிறது | பாலி(A) வால்கள் கொண்ட மரபணுக்களை பெருக்குவதற்கு மட்டுமே பொருத்தமானது
பாலி(A) இல் ப்ரைமிங் தளம்*2 இலிருந்து துண்டிக்கப்பட்ட cDNA ஐப் பெறவும்
3′ இறுதி வரை பிணைக்க ஒரு சார்பு*
*நங்கூரமிட்ட ஒலிகோ(dT) ப்ரைமர்கள் பயன்படுத்தப்பட்டால் இந்த சாத்தியம் குறைக்கப்படும் |
சீரற்ற ப்ரைமர்
| 6 முதல் 9 தளங்கள் நீளம், ஆர்என்ஏ டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் போது பல தளங்களுக்கு இணைக்க முடியும் | அனைத்து ஆர்என்ஏக்கள் (டிஆர்என்ஏ, ஆர்ஆர்என்ஏ மற்றும் எம்ஆர்என்ஏ)
குறிப்பிடத்தக்க இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பைக் கொண்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளுக்கு ஏற்றது அல்லது குறைவான தொடக்கப் பொருள் கிடைக்கும் போது
உயர் cDNA மகசூல் | சிடிஎன்ஏ அனைத்து ஆர்என்ஏவிலிருந்தும் தலைகீழ் படியெடுக்கப்பட்டது, இது பொதுவாக விரும்பப்படுவதில்லை மற்றும் இலக்கு எம்ஆர்என்ஏவின் சமிக்ஞையை நீர்த்துப்போகச் செய்யலாம்.
துண்டிக்கப்பட்ட cDNA கிடைக்கும் |
வரிசை-குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள் | குறிப்பிட்ட mRNA வரிசைகளை குறிவைக்கும் தனிப்பயன் ப்ரைமர்கள் | குறிப்பிட்ட cDNA நூலகம்
உணர்திறனை மேம்படுத்தவும்
தலைகீழ் qPCR ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்துதல் | ஒற்றை இலக்கு மரபணுவின் தொகுப்புக்கு மட்டுமே வரையறுக்கப்பட்டுள்ளது |
தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ்
ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் என்பது டிஎன்ஏவை ஒருங்கிணைக்க ஆர்என்ஏவைப் பயன்படுத்தும் என்சைம் ஆகும்.சில தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ்கள் RNase செயல்பாட்டைக் கொண்டிருக்கின்றன மற்றும் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்குப் பிறகு RNA-DNA கலப்பின இழைகளில் RNA இழைகளை சிதைக்கலாம்.RNase நொதி செயல்பாடு இல்லை என்றால், RNaseH ஐ அதிக qPCR செயல்திறனுக்காக சேர்க்கலாம்.பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் என்சைம்களில் மோலோனி முரைன் லுகேமியா வைரஸ் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் மற்றும் ஏவியன் மைலோபிளாஸ்டோமா வைரஸ் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் ஆகியவை அடங்கும்.RT-qPCRக்கு, அதிக தெர்மோஸ்டபிலிட்டி கொண்ட தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸைத் தேர்ந்தெடுப்பது சிறந்தது, இதனால் சிடிஎன்ஏ தொகுப்பு அதிக வெப்பநிலையில் செய்யப்படுகிறது, உயர் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பைக் கொண்ட ஆர்என்ஏக்களின் வெற்றிகரமான டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனை உறுதிசெய்கிறது, அதே நேரத்தில் எதிர்வினை முழுவதும் அவற்றின் முழு செயல்பாட்டையும் பராமரிக்கிறது, இதன் விளைவாக அதிக சிடிஎன்ஏ விளைச்சல் கிடைக்கும்.
தொடர்புடைய தயாரிப்புகள்:
முன்னறிவிப்பு M-MLV தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ்
தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸின் RNase H செயல்பாடு
RNaseH ஆனது RNA-DNA டூப்ளெக்ஸ்களில் இருந்து RNA இழைகளை சிதைக்க முடியும், இது இரட்டை இழை DNA வின் திறமையான தொகுப்பை அனுமதிக்கிறது.இருப்பினும், நீண்ட எம்ஆர்என்ஏவை டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தும் போது, ஆர்என்ஏ முன்கூட்டியே சிதைந்துவிடும், இதன் விளைவாக சிடிஎன்ஏ துண்டிக்கப்படும்.எனவே, சிடிஎன்ஏ குளோனிங்கின் போது நீண்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளின் தொகுப்பு விரும்பினால் RNaseH செயல்பாட்டைக் குறைப்பது பெரும்பாலும் நன்மை பயக்கும்.இதற்கு நேர்மாறாக, RNase H செயல்பாட்டுடன் கூடிய தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ்கள் qPCR பயன்பாடுகளுக்குப் பலனளிக்கின்றன, ஏனெனில் அவை PCR இன் முதல் சுழற்சியின் போது RNA-DNA டூப்ளெக்ஸ்களின் உருகலை மேம்படுத்துகின்றன.
ப்ரைமர் வடிவமைப்பு
RT-qPCR இல் qPCR படிக்கு பயன்படுத்தப்படும் PCR ப்ரைமர்கள் ஒரு எக்ஸான்-எக்ஸான் சந்திப்பை விரிவுபடுத்தும் வகையில் வடிவமைக்கப்பட வேண்டும், அங்கு ஒரு பெருக்க ப்ரைமர் உண்மையான எக்ஸான்-இன்ட்ரான் எல்லையை விரிவுபடுத்தும்.இன்ட்ரான் கொண்ட மரபணு டிஎன்ஏ வரிசைகள் பெருக்கப்படாததால், இந்த வடிவமைப்பு மரபணு டிஎன்ஏவை மாசுபடுத்துவதால் பெருக்கப்படும் தவறான நேர்மறைகளின் அபாயத்தைக் குறைக்கிறது.
எக்ஸான்கள் அல்லது எக்ஸான்-எக்ஸான் எல்லைகளை பிரிக்க ப்ரைமர்களை வடிவமைக்க முடியாவிட்டால், மரபணு டிஎன்ஏ மாசுபாட்டை அகற்ற ஆர்என்ஏ மாதிரிகளை ஆர்என்ஏ-இலவச DNase I அல்லது dsDNase உடன் சிகிச்சை செய்வது அவசியமாக இருக்கலாம்.
RT-qPCR கட்டுப்பாடு
டிஎன்ஏ மாசுபாட்டைக் கண்டறிய அனைத்து RT-qPCR சோதனைகளிலும் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் எதிர்மறை கட்டுப்பாடு (-RT கட்டுப்பாடு) சேர்க்கப்பட வேண்டும் (முந்தைய எதிர்வினைகளிலிருந்து மரபணு DNA அல்லது PCR தயாரிப்புகள் போன்றவை).இந்த கட்டுப்பாடு தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் தவிர அனைத்து எதிர்வினை கூறுகளையும் கொண்டுள்ளது.இந்தக் கட்டுப்பாட்டுடன் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் நிகழாததால், PCR பெருக்கம் காணப்பட்டால், டிஎன்ஏவில் இருந்து மாசுபடுவதற்கான வாய்ப்புகள் அதிகம்.
இடுகை நேரம்: ஆகஸ்ட்-02-2022