1. அடிப்படை அறிவு (பரிசோதனை பகுதியை நீங்கள் பார்க்க விரும்பினால், இரண்டாவது பகுதிக்கு நேரடியாக மாற்றவும்)

வழக்கமான பிசிஆரின் வழித்தோன்றல் எதிர்வினையாக, நிகழ்நேர பிசிஆர் முக்கியமாக பிசிஆர் பெருக்க வினையின் ஒவ்வொரு சுழற்சியிலும் ஃப்ளோரசன் சிக்னலின் மாற்றத்தின் மூலம் நிகழ்நேரத்தில் பெருக்க உற்பத்தியின் அளவு மாற்றத்தைக் கண்காணிக்கிறது, மேலும் சிடி மதிப்புக்கும் நிலையான வளைவுக்கும் இடையிலான உறவின் மூலம் தொடக்க டெம்ப்ளேட்டை அளவுரீதியாக பகுப்பாய்வு செய்கிறது.

RT-PCR இன் குறிப்பிட்ட தரவுஅடிப்படை, ஃப்ளோரசன்ஸ் வாசல்மற்றும்Ct மதிப்பு.

RT-PCR க்கான பொதுவான லேபிளிங் முறைகள்:

2. பரிசோதனை படிகள்

2.1 சோதனைக் குழுவைப் பற்றி- குழுவில் பல கிணறுகள் இருக்க வேண்டும், மேலும் உயிரியல் மறுபடியும் இருக்க வேண்டும்.

2.2 ப்ரைமர் வடிவமைப்பின் கோட்பாடுகள்

①SiRNA இனங்கள் சார்ந்தது, மேலும் வெவ்வேறு இனங்களின் வரிசைகள் வேறுபட்டதாக இருக்கும்.

②SiRNA உறைந்த-உலர்ந்த தூளில் தொகுக்கப்பட்டுள்ளது, இது அறை வெப்பநிலையில் 2-4 வாரங்களுக்கு நிலையானதாக சேமிக்கப்படும்.

2.3 முன்கூட்டியே தயார் செய்ய வேண்டிய கருவிகள் அல்லது எதிர்வினைகள்

2.4 குறிப்பிட்ட சோதனை நடவடிக்கைகளில் கவனம் செலுத்த வேண்டிய சிக்கல்கள் குறித்து:

①siRNA பரிமாற்ற செயல்முறை

1. முலாம் பூசுவதற்கு, நீங்கள் 24-கிணறு தட்டு, 12-கிணறு தகடு அல்லது 6-கிணறு தட்டு (24-கிணறு தகட்டின் ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் பரிந்துரைக்கப்பட்ட சராசரி RNA செறிவு சுமார் 100-300 ng/uL ஆகும்), மேலும் செல்களின் உகந்த இடமாற்ற அடர்த்தி 60 %-80% வரை இருக்கும்

2. இடமாற்றம் படிகள் மற்றும் குறிப்பிட்ட தேவைகள் கண்டிப்பாக அறிவுறுத்தல்களுக்கு இணங்க உள்ளன.

3. இடமாற்றத்திற்குப் பிறகு, மாதிரிகள் 24-72 மணி நேரத்திற்குள் mRNA கண்டறிதல் (RT-PCR) அல்லது புரதம் கண்டறிதல் 48-96 மணி நேரத்திற்குள் (WB)

② ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல் செயல்முறை

1. வெளிப்புற நொதிகளால் மாசுபடுவதைத் தடுக்கவும்.இது முக்கியமாக முகமூடிகள் மற்றும் கையுறைகளை கண்டிப்பாக அணிவதை உள்ளடக்கியது;கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட்ட குழாய் குறிப்புகள் மற்றும் EP குழாய்களைப் பயன்படுத்துதல்;பரிசோதனையில் பயன்படுத்தப்படும் நீர் RNase-இல்லாததாக இருக்க வேண்டும்.

2. விரைவு பிரித்தெடுத்தல் கருவியில் பரிந்துரைக்கப்பட்டபடி இரண்டு முறை செய்ய பரிந்துரைக்கப்படுகிறது, இது உண்மையில் தூய்மை மற்றும் விளைச்சலை மேம்படுத்தும்.

3. கழிவு திரவம் ஆர்என்ஏ நெடுவரிசையைத் தொடக்கூடாது.

③ RNA அளவீடு

ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுக்கப்பட்ட பிறகு, அதை நேரடியாக நானோட்ராப் மூலம் அளவிட முடியும், மேலும் குறைந்தபட்ச அளவீடு 10ng/ul ஆகவும் இருக்கலாம்.

④ தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்முறை

1. RT-qPCR இன் அதிக உணர்திறன் காரணமாக, ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும் குறைந்தபட்சம் 3 இணையான கிணறுகள் செய்யப்பட வேண்டும், பின்னர் வரும் Ct மிகவும் வித்தியாசமாக இருப்பதைத் தடுக்க வேண்டும் அல்லது புள்ளியியல் பகுப்பாய்விற்கு SD மிகவும் பெரியதாக இருக்க வேண்டும்.

2. மாஸ்டர் கலவையை மீண்டும் மீண்டும் உறைய வைத்து கரைக்க வேண்டாம்.

3. ஒவ்வொரு குழாய்/துளையும் ஒரு புதிய முனையுடன் மாற்றப்பட வேண்டும்!மாதிரிகளைச் சேர்க்க ஒரே பைப்பெட் முனையைத் தொடர்ந்து பயன்படுத்த வேண்டாம்!

4. மாதிரியைச் சேர்த்த பிறகு 96-கிணறு தட்டில் இணைக்கப்பட்ட படம் ஒரு தட்டு மூலம் மென்மையாக்கப்பட வேண்டும்.இயந்திரத்தில் வைப்பதற்கு முன் மையவிலக்கு செய்வது சிறந்தது, இதனால் குழாய் சுவரில் உள்ள திரவம் கீழே பாய்ந்து காற்று குமிழ்களை அகற்றும்.

⑤பொதுவான வளைவு பகுப்பாய்வு

2.5 தரவு பகுப்பாய்வு பற்றி

qPCR இன் தரவு பகுப்பாய்வு உறவினர் அளவீடு மற்றும் முழுமையான அளவு என பிரிக்கலாம்.எடுத்துக்காட்டாக, கட்டுப்பாட்டுக் குழுவில் உள்ள செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது சிகிச்சை குழுவில் உள்ள செல்கள்,

X மரபணுவின் mRNA எத்தனை முறை மாறுகிறது, இது ஒப்பீட்டு அளவீடு ஆகும்;குறிப்பிட்ட எண்ணிக்கையிலான செல்களில், X மரபணுவின் mRNA

எத்தனை பிரதிகள் உள்ளன, இது முழுமையான அளவு.பொதுவாக ஆய்வகத்தில் நாம் அதிகம் பயன்படுத்துவது ஒப்பீட்டு அளவு முறை.பொதுவாக,2-ΔΔct முறைசோதனைகளில் அதிகம் பயன்படுத்தப்படுகிறது, எனவே இந்த முறை மட்டுமே இங்கு விரிவாக அறிமுகப்படுத்தப்படும்.

2-ΔΔct முறை: பெறப்பட்ட முடிவு, கட்டுப்பாட்டுக் குழுவில் உள்ள இலக்கு மரபணுவுடன் தொடர்புடைய சோதனைக் குழுவில் இலக்கு மரபணுவின் வெளிப்பாட்டின் வேறுபாடு ஆகும்.இலக்கு மரபணு மற்றும் உள் குறிப்பு மரபணு இரண்டின் பெருக்க செயல்திறன் 100% க்கு அருகில் இருக்க வேண்டும், மேலும் ஒப்பீட்டு விலகல் 5% ஐ விட அதிகமாக இருக்கக்கூடாது.

கணக்கீட்டு முறை பின்வருமாறு:

Δct கட்டுப்பாட்டு குழு = கட்டுப்பாட்டு குழுவில் இலக்கு மரபணுவின் ct மதிப்பு - கட்டுப்பாட்டு குழுவில் உள்ள உள் குறிப்பு மரபணுவின் ct மதிப்பு

Δct சோதனைக் குழு = சோதனைக் குழுவில் உள்ள இலக்கு மரபணுவின் ct மதிப்பு - சோதனைக் குழுவில் உள்ள உள் குறிப்பு மரபணுவின் ct மதிப்பு

ΔΔct=Δct சோதனைக் குழு-Δct கட்டுப்பாட்டுக் குழு

இறுதியாக, வெளிப்பாடு மட்டத்தில் உள்ள வேறுபாட்டின் மடங்குகளைக் கணக்கிடுங்கள்:

மடிப்பு=2-ΔΔct ஐ மாற்றவும் (எக்செல் செயல்பாட்டிற்கு ஏற்றது POWER)

தொடர்புடைய தயாரிப்புகள்:

செல் நேரடி RT-qPCR கிட்