1. அடிப்படை அறிவு (பரிசோதனை பகுதியை நீங்கள் பார்க்க விரும்பினால், இரண்டாவது பகுதிக்கு நேரடியாக மாற்றவும்)
வழக்கமான பிசிஆரின் வழித்தோன்றல் எதிர்வினையாக, நிகழ்நேர பிசிஆர் முக்கியமாக பிசிஆர் பெருக்க வினையின் ஒவ்வொரு சுழற்சியிலும் ஃப்ளோரசன் சிக்னலின் மாற்றத்தின் மூலம் நிகழ்நேரத்தில் பெருக்க உற்பத்தியின் அளவு மாற்றத்தைக் கண்காணிக்கிறது, மேலும் சிடி மதிப்புக்கும் நிலையான வளைவுக்கும் இடையிலான உறவின் மூலம் தொடக்க டெம்ப்ளேட்டை அளவுரீதியாக பகுப்பாய்வு செய்கிறது.
RT-PCR இன் குறிப்பிட்ட தரவுஅடிப்படை, ஃப்ளோரசன்ஸ் வாசல்மற்றும்Ct மதிப்பு.
அடிப்படை: | 3 வது-15 வது சுழற்சியின் ஒளிரும் மதிப்பு அடிப்படை (அடிப்படை) ஆகும், இது அளவீட்டின் அவ்வப்போது பிழை ஏற்படுகிறது. |
வாசல் (வாசல்): | பெருக்க வளைவின் அதிவேக வளர்ச்சிப் பகுதியில் பொருத்தமான நிலையில் அமைக்கப்பட்ட ஃப்ளோரசன்ஸ் கண்டறிதல் வரம்பைக் குறிக்கிறது, பொதுவாக அடிப்படையின் நிலையான விலகலை விட 10 மடங்கு அதிகம். |
CT மதிப்பு: | ஒவ்வொரு எதிர்வினைக் குழாயிலும் உள்ள ஒளிரும் மதிப்பு வாசலை அடையும் போது இது PCR சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையாகும். Ct மதிப்பு ஆரம்ப டெம்ப்ளேட்டின் அளவிற்கு நேர்மாறான விகிதாசாரமாகும். |
RT-PCR க்கான பொதுவான லேபிளிங் முறைகள்:
முறை | நன்மை | குறைபாடு | பயன்பாட்டின் நோக்கம் |
SYBR பசுமைⅠ | பரந்த பொருந்தக்கூடிய தன்மை, உணர்திறன், மலிவான மற்றும் வசதியானது | ப்ரைமர் தேவைகள் அதிகம், குறிப்பிட்ட அல்லாத பட்டைகளுக்கு வாய்ப்புகள் அதிகம் | இது பல்வேறு இலக்கு மரபணுக்களின் அளவு பகுப்பாய்வு, மரபணு வெளிப்பாடு பற்றிய ஆராய்ச்சி மற்றும் டிரான்ஸ்ஜெனிக் மறுசீரமைப்பு விலங்குகள் மற்றும் தாவரங்கள் பற்றிய ஆராய்ச்சிக்கு ஏற்றது. |
தக்மான் | நல்ல விவரக்குறிப்பு மற்றும் அதிக மறுநிகழ்வு | விலை அதிகம் மற்றும் குறிப்பிட்ட இலக்குகளுக்கு மட்டுமே பொருத்தமானது. | நோய்க்கிருமி கண்டறிதல், மருந்து எதிர்ப்பு மரபணு ஆராய்ச்சி, மருந்து செயல்திறன் மதிப்பீடு, மரபணு நோய்களைக் கண்டறிதல். |
மூலக்கூறு கலங்கரை விளக்கம் | உயர் விவரக்குறிப்பு, ஒளிரும் தன்மை, குறைந்த பின்னணி | விலை அதிகமாக உள்ளது, இது ஒரு குறிப்பிட்ட நோக்கத்திற்காக மட்டுமே பொருத்தமானது, வடிவமைப்பு கடினம், மற்றும் விலை அதிகமாக உள்ளது. | குறிப்பிட்ட மரபணு பகுப்பாய்வு, SNP பகுப்பாய்வு |
2. பரிசோதனை படிகள்
2.1 சோதனைக் குழுவைப் பற்றி- குழுவில் பல கிணறுகள் இருக்க வேண்டும், மேலும் உயிரியல் மறுபடியும் இருக்க வேண்டும்.
① | வெற்று கட்டுப்பாடு | சோதனைகளில் செல் வளர்ச்சி நிலையைக் கண்டறியப் பயன்படுகிறது |
② | எதிர்மறை கட்டுப்பாடு siRNA (குறிப்பிடாத siRNA வரிசை) | RNAi செயலின் தனித்தன்மையை விளக்கவும்.siRNA 200nM செறிவில் குறிப்பிட்ட அழுத்தமற்ற பதிலைத் தூண்டலாம். |
③ | பரிமாற்ற ரீஜென்ட் கட்டுப்பாடு | உயிரணுக்களுக்கு மாற்றும் வினைப்பொருளின் நச்சுத்தன்மை அல்லது இலக்கு மரபணுவின் வெளிப்பாட்டின் மீதான விளைவை விலக்கு |
④ | இலக்கு மரபணுவிற்கு எதிராக siRNA | இலக்கு மரபணுவின் வெளிப்பாட்டைத் தட்டவும் |
⑤ (விரும்பினால்) | நேர்மறை siRNA | சோதனை முறைமை மற்றும் செயல்பாட்டுச் சிக்கல்களைத் தீர்க்கப் பயன்படுகிறது |
⑥ (விரும்பினால்) | ஃப்ளோரசன்ட் கட்டுப்பாடு siRNA | செல் பரிமாற்றத்தின் செயல்திறனை நுண்ணோக்கி மூலம் காணலாம் |
2.2 ப்ரைமர் வடிவமைப்பின் கோட்பாடுகள்
பெருக்கப்பட்ட துண்டு அளவு | முன்னுரிமை 100-150bp இல் |
ப்ரைமர் நீளம் | 18-25bp |
GC உள்ளடக்கம் | 30% -70%, முன்னுரிமை 45% -55% |
டிஎம் மதிப்பு | 58-60℃ |
வரிசை | T/C தொடர்ச்சியைத் தவிர்க்கவும்;ஏ/ஜி தொடர்ச்சி |
3 இறுதி வரிசை | GC பணக்காரர் அல்லது AT பணக்காரர்களைத் தவிர்க்கவும்;டெர்மினல் பேஸ் முன்னுரிமை G அல்லது C;டியைத் தவிர்ப்பது நல்லது |
நிரப்புத்தன்மை | ப்ரைமருக்குள் அல்லது இரண்டு ப்ரைமர்களுக்கு இடையில் 3 தளங்களுக்கு மேல் உள்ள நிரப்பு வரிசைகளைத் தவிர்க்கவும் |
குறிப்பிட்ட | ப்ரைமர் விவரக்குறிப்பை உறுதிப்படுத்த வெடிப்பு தேடலைப் பயன்படுத்தவும் |
①SiRNA இனங்கள் சார்ந்தது, மேலும் வெவ்வேறு இனங்களின் வரிசைகள் வேறுபட்டதாக இருக்கும்.
②SiRNA உறைந்த-உலர்ந்த தூளில் தொகுக்கப்பட்டுள்ளது, இது அறை வெப்பநிலையில் 2-4 வாரங்களுக்கு நிலையானதாக சேமிக்கப்படும்.
2.3 முன்கூட்டியே தயார் செய்ய வேண்டிய கருவிகள் அல்லது எதிர்வினைகள்
ப்ரைமர் (உள் குறிப்பு) | முன்னோக்கி மற்றும் தலைகீழ் இரண்டு உட்பட |
ப்ரைமர்கள் (இலக்கு மரபணு) | முன்னோக்கி மற்றும் தலைகீழ் இரண்டு உட்பட |
இலக்கு Si RNA (3 கீற்றுகள்) | பொதுவாக, நிறுவனம் 3 கீற்றுகளை ஒருங்கிணைத்து, பின்னர் RT-PCR மூலம் மூன்றில் ஒன்றைத் தேர்ந்தெடுக்கும். |
இடமாற்ற கிட் | Lipo2000 போன்றவை. |
ஆர்என்ஏ ரேபிட் எக்ஸ்ட்ராக்ஷன் கிட் | இடமாற்றத்திற்குப் பிறகு ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுப்பதற்கு |
ரேபிட் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் கிட் | cDNA தொகுப்புக்காக |
PCR பெருக்க கருவி | 2×சூப்பர் SYBR பச்சை qPCR மாஸ்டர் மிக்ஸ் |
2.4 குறிப்பிட்ட சோதனை நடவடிக்கைகளில் கவனம் செலுத்த வேண்டிய சிக்கல்கள் குறித்து:
①siRNA பரிமாற்ற செயல்முறை
1. முலாம் பூசுவதற்கு, நீங்கள் 24-கிணறு தட்டு, 12-கிணறு தகடு அல்லது 6-கிணறு தட்டு (24-கிணறு தகட்டின் ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் பரிந்துரைக்கப்பட்ட சராசரி RNA செறிவு சுமார் 100-300 ng/uL ஆகும்), மேலும் செல்களின் உகந்த இடமாற்ற அடர்த்தி 60 %-80% வரை இருக்கும்
2. இடமாற்றம் படிகள் மற்றும் குறிப்பிட்ட தேவைகள் கண்டிப்பாக அறிவுறுத்தல்களுக்கு இணங்க உள்ளன.
3. இடமாற்றத்திற்குப் பிறகு, மாதிரிகள் 24-72 மணி நேரத்திற்குள் mRNA கண்டறிதல் (RT-PCR) அல்லது புரதம் கண்டறிதல் 48-96 மணி நேரத்திற்குள் (WB)
② ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல் செயல்முறை
1. வெளிப்புற நொதிகளால் மாசுபடுவதைத் தடுக்கவும்.இது முக்கியமாக முகமூடிகள் மற்றும் கையுறைகளை கண்டிப்பாக அணிவதை உள்ளடக்கியது;கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட்ட குழாய் குறிப்புகள் மற்றும் EP குழாய்களைப் பயன்படுத்துதல்;பரிசோதனையில் பயன்படுத்தப்படும் நீர் RNase-இல்லாததாக இருக்க வேண்டும்.
2. விரைவு பிரித்தெடுத்தல் கருவியில் பரிந்துரைக்கப்பட்டபடி இரண்டு முறை செய்ய பரிந்துரைக்கப்படுகிறது, இது உண்மையில் தூய்மை மற்றும் விளைச்சலை மேம்படுத்தும்.
3. கழிவு திரவம் ஆர்என்ஏ நெடுவரிசையைத் தொடக்கூடாது.
③ RNA அளவீடு
ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுக்கப்பட்ட பிறகு, அதை நேரடியாக நானோட்ராப் மூலம் அளவிட முடியும், மேலும் குறைந்தபட்ச அளவீடு 10ng/ul ஆகவும் இருக்கலாம்.
④ தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்முறை
1. RT-qPCR இன் அதிக உணர்திறன் காரணமாக, ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும் குறைந்தபட்சம் 3 இணையான கிணறுகள் செய்யப்பட வேண்டும், பின்னர் வரும் Ct மிகவும் வித்தியாசமாக இருப்பதைத் தடுக்க வேண்டும் அல்லது புள்ளியியல் பகுப்பாய்விற்கு SD மிகவும் பெரியதாக இருக்க வேண்டும்.
2. மாஸ்டர் கலவையை மீண்டும் மீண்டும் உறைய வைத்து கரைக்க வேண்டாம்.
3. ஒவ்வொரு குழாய்/துளையும் ஒரு புதிய முனையுடன் மாற்றப்பட வேண்டும்!மாதிரிகளைச் சேர்க்க ஒரே பைப்பெட் முனையைத் தொடர்ந்து பயன்படுத்த வேண்டாம்!
4. மாதிரியைச் சேர்த்த பிறகு 96-கிணறு தட்டில் இணைக்கப்பட்ட படம் ஒரு தட்டு மூலம் மென்மையாக்கப்பட வேண்டும்.இயந்திரத்தில் வைப்பதற்கு முன் மையவிலக்கு செய்வது சிறந்தது, இதனால் குழாய் சுவரில் உள்ள திரவம் கீழே பாய்ந்து காற்று குமிழ்களை அகற்றும்.
⑤பொதுவான வளைவு பகுப்பாய்வு
மடக்கை வளர்ச்சியின் காலம் இல்லை | டெம்ப்ளேட்டின் அதிக செறிவு இருக்கலாம் |
CT மதிப்பு இல்லை | ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னல்களைக் கண்டறிவதற்கான தவறான படிகள்; ப்ரைமர்கள் அல்லது ஆய்வுகளின் சிதைவு - அதன் ஒருமைப்பாடு PAGE எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் கண்டறியப்படுகிறது; டெம்ப்ளேட்டின் போதுமான அளவு இல்லை; வார்ப்புருக்களின் சீரழிவு - மாதிரி தயாரிப்பில் அசுத்தங்கள் மற்றும் மீண்டும் மீண்டும் உறைதல் மற்றும் உருகுவதைத் தவிர்ப்பது; |
Ct>38 | குறைந்த பெருக்க திறன்;PCR தயாரிப்பு மிக நீளமானது;பல்வேறு எதிர்வினை கூறுகள் சிதைக்கப்படுகின்றன |
நேரியல் பெருக்க வளைவு | மீண்டும் மீண்டும் உறைதல்-கரை சுழற்சிகள் அல்லது நீண்ட நேரம் ஒளியை வெளிப்படுத்துவதன் மூலம் ஆய்வுகள் பகுதியளவு சிதைக்கப்படலாம். |
நகல் துளைகளில் உள்ள வேறுபாடு குறிப்பாக பெரியது | எதிர்வினை தீர்வு முற்றிலும் உருகவில்லை அல்லது எதிர்வினை தீர்வு கலக்கப்படவில்லை;PCR கருவியின் வெப்ப குளியல் ஒளிரும் பொருட்களால் மாசுபட்டுள்ளது |
2.5 தரவு பகுப்பாய்வு பற்றி
qPCR இன் தரவு பகுப்பாய்வு உறவினர் அளவீடு மற்றும் முழுமையான அளவு என பிரிக்கலாம்.எடுத்துக்காட்டாக, கட்டுப்பாட்டுக் குழுவில் உள்ள செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது சிகிச்சை குழுவில் உள்ள செல்கள்,
X மரபணுவின் mRNA எத்தனை முறை மாறுகிறது, இது ஒப்பீட்டு அளவீடு ஆகும்;குறிப்பிட்ட எண்ணிக்கையிலான செல்களில், X மரபணுவின் mRNA
எத்தனை பிரதிகள் உள்ளன, இது முழுமையான அளவு.பொதுவாக ஆய்வகத்தில் நாம் அதிகம் பயன்படுத்துவது ஒப்பீட்டு அளவு முறை.பொதுவாக,2-ΔΔct முறைசோதனைகளில் அதிகம் பயன்படுத்தப்படுகிறது, எனவே இந்த முறை மட்டுமே இங்கு விரிவாக அறிமுகப்படுத்தப்படும்.
2-ΔΔct முறை: பெறப்பட்ட முடிவு, கட்டுப்பாட்டுக் குழுவில் உள்ள இலக்கு மரபணுவுடன் தொடர்புடைய சோதனைக் குழுவில் இலக்கு மரபணுவின் வெளிப்பாட்டின் வேறுபாடு ஆகும்.இலக்கு மரபணு மற்றும் உள் குறிப்பு மரபணு இரண்டின் பெருக்க செயல்திறன் 100% க்கு அருகில் இருக்க வேண்டும், மேலும் ஒப்பீட்டு விலகல் 5% ஐ விட அதிகமாக இருக்கக்கூடாது.
கணக்கீட்டு முறை பின்வருமாறு:
Δct கட்டுப்பாட்டு குழு = கட்டுப்பாட்டு குழுவில் இலக்கு மரபணுவின் ct மதிப்பு - கட்டுப்பாட்டு குழுவில் உள்ள உள் குறிப்பு மரபணுவின் ct மதிப்பு
Δct சோதனைக் குழு = சோதனைக் குழுவில் உள்ள இலக்கு மரபணுவின் ct மதிப்பு - சோதனைக் குழுவில் உள்ள உள் குறிப்பு மரபணுவின் ct மதிப்பு
ΔΔct=Δct சோதனைக் குழு-Δct கட்டுப்பாட்டுக் குழு
இறுதியாக, வெளிப்பாடு மட்டத்தில் உள்ள வேறுபாட்டின் மடங்குகளைக் கணக்கிடுங்கள்:
மடிப்பு=2-ΔΔct ஐ மாற்றவும் (எக்செல் செயல்பாட்டிற்கு ஏற்றது POWER)
தொடர்புடைய தயாரிப்புகள்:
இடுகை நேரம்: மே-20-2023