一, எதிர்வினை அமைப்பின் உணர்திறனை அதிகரிக்கவும்:

1. உயர்தர RNA ஐ தனிமைப்படுத்தவும்:

வெற்றிகரமான சிடிஎன்ஏ தொகுப்பு உயர்தர ஆர்என்ஏவில் இருந்து வருகிறது.உயர்தர ஆர்என்ஏ குறைந்தபட்சம் முழு நீளமாகவும், ஈடிடிஏ அல்லது எஸ்டிஎஸ் போன்ற ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் இன்ஹிபிட்டர்கள் இல்லாததாகவும் இருக்க வேண்டும்.ஆர்என்ஏவின் தரமானது, சிடிஎன்ஏவில் நீங்கள் படியெடுக்கக்கூடிய அதிகபட்ச வரிசைத் தகவலைத் தீர்மானிக்கிறது.ஒரு பொதுவான ஆர்என்ஏ சுத்திகரிப்பு முறையானது குவானிடைன் ஐசோதியோசயனேட்/ஆசிட் பீனாலைப் பயன்படுத்தி ஒரு-படி முறையாகும்.RNase இன் அளவுகளால் மாசுபடுவதைத் தடுக்க, RNase நிறைந்த மாதிரிகளிலிருந்து (கணையம் போன்றவை) தனிமைப்படுத்தப்பட்ட RNA, உயர்தர RNA ஐப் பாதுகாக்க, குறிப்பாக நீண்ட கால சேமிப்பிற்காக, ஃபார்மால்டிஹைடில் சேமிக்கப்பட வேண்டும்.எலி கல்லீரலில் இருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏ அடிப்படையில் ஒரு வாரம் தண்ணீரில் சேமிக்கப்பட்ட பிறகு சிதைக்கப்பட்டது, அதே நேரத்தில் எலி மண்ணீரலில் இருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏ 3 ஆண்டுகள் தண்ணீரில் சேமிக்கப்பட்ட பிறகு நிலையானதாக இருந்தது.கூடுதலாக, சிறிய டிரான்ஸ்கிரிப்ட்களை விட 4 kb க்கும் அதிகமான டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் டிரேஸ் RNases மூலம் சிதைவுக்கு அதிக உணர்திறன் கொண்டவை.சேமிக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏ மாதிரிகளின் நிலைத்தன்மையை அதிகரிக்க, ஆர்என்ஏவை டீயோனைஸ்டு ஃபார்மைடில் கரைத்து -70 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் சேமிக்கலாம்.ஆர்என்ஏவைப் பாதுகாக்கப் பயன்படுத்தப்படும் ஃபார்மமைடு, ஆர்என்ஏவைச் சிதைக்கும் குப்பைகள் இல்லாமல் இருக்க வேண்டும்.கணையத்தில் இருந்து வரும் ஆர்என்ஏவை ஃபார்மைடில் குறைந்தது ஒரு வருடமாவது பாதுகாக்க முடியும்.ஆர்என்ஏவைப் பயன்படுத்தத் தயாராகும் போது, ​​நீங்கள் ஆர்என்ஏவைத் துரிதப்படுத்த பின்வரும் முறையைப் பயன்படுத்தலாம்: NaCl ஐ 0.2M மற்றும் 4 மடங்கு எத்தனாலைச் சேர்க்கவும், அறை வெப்பநிலையில் 3-5 நிமிடங்கள் வைக்கவும், மற்றும் 5 நிமிடங்களுக்கு 10,000×g இல் மையவிலக்கு செய்யவும்.

2. RNaseH-செயலற்ற (RNaseH-) தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸைப் பயன்படுத்தவும்:

சிடிஎன்ஏ தொகுப்பின் நீளம் மற்றும் விளைச்சலை அதிகரிக்க RNase தடுப்பான்கள் பெரும்பாலும் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் எதிர்வினைகளில் சேர்க்கப்படுகின்றன.RNase இன்ஹிபிட்டர்கள் ஒரு இடையக மற்றும் குறைக்கும் முகவர் (DTT போன்றவை) முன்னிலையில் முதல் இழை தொகுப்பு வினையின் போது சேர்க்கப்பட வேண்டும், ஏனெனில் cDNA தொகுப்புக்கு முந்தைய செயல்முறை தடுப்பானை குறைக்கிறது, இதனால் ஆர்என்ஏவை சிதைக்கக்கூடிய பிணைப்பு RNase ஐ வெளியிடுகிறது.புரோட்டீன் RNase தடுப்பான்கள் RNase A, B, C ஆல் ஆர்என்ஏ சிதைவதைத் தடுக்கின்றன, மேலும் தோலில் RNase ஐத் தடுக்காது, எனவே இந்த தடுப்பான்களைப் பயன்படுத்தினாலும் உங்கள் விரல்களில் இருந்து RNase ஐ அறிமுகப்படுத்தாமல் கவனமாக இருங்கள்.

ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் ஆர்என்ஏவை சிடிஎன்ஏவாக மாற்றுவதற்கு ஊக்கமளிக்கிறது.M-MLV மற்றும் AMV இரண்டும் அவற்றின் சொந்த பாலிமரேஸ் செயல்பாட்டிற்கு கூடுதலாக உள்நோக்கிய RNaseH செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளன.RNaseH செயல்பாடு மற்றும் பாலிமரேஸ் செயல்பாடு ஆகியவை RNA டெம்ப்ளேட் மற்றும் DNA ப்ரைமர் அல்லது cDNA நீட்டிப்பு இழைக்கு இடையே உருவாகும் கலப்பின இழைக்கு ஒன்றுக்கொன்று போட்டியிடுகின்றன, மேலும் ஆர்என்ஏ:டிஎன்ஏ வளாகத்தில் உள்ள ஆர்என்ஏ இழையை சிதைக்கிறது.RNaseH செயல்பாட்டால் சிதைக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏ டெம்ப்ளேட் இனி சிடிஎன்ஏ தொகுப்புக்கான பயனுள்ள அடி மூலக்கூறாக செயல்படாது, இது சிடிஎன்ஏ தொகுப்பின் விளைச்சலையும் நீளத்தையும் குறைக்கிறது.எனவே, தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸின் RNaseH செயல்பாட்டை அகற்றுவது அல்லது வெகுவாகக் குறைப்பது நன்மை பயக்கும்.

சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட் Ⅱ ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ், RNaseH- MMLV ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் மற்றும் தெர்மோஸ்கிரிப்ட் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ், RNaseH- AMV ஆகியவை MMLV மற்றும் AMV ஐ விட அதிக அளவு மற்றும் முழு நீள சிடிஎன்ஏவைப் பெறலாம்.RT-PCR உணர்திறன் சிடிஎன்ஏ தொகுப்பின் அளவு பாதிக்கப்படும்.AMV ஐ விட தெர்மோஸ்கிரிப்ட் அதிக உணர்திறன் கொண்டது.RT-PCR தயாரிப்புகளின் அளவு சிடிஎன்ஏவை ஒருங்கிணைக்க ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸின் திறனால் வரையறுக்கப்படுகிறது, குறிப்பாக பெரிய சிடிஎன்ஏக்களை குளோனிங் செய்யும் போது.MMLV உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​SuperScripⅡ நீண்ட RT-PCR தயாரிப்புகளின் விளைச்சலை கணிசமாக அதிகரித்தது.RNaseH-தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸும் தெர்மோஸ்டெபிலிட்டியை அதிகப்படுத்தியுள்ளது, எனவே இயல்பான 37-42°C ஐ விட அதிக வெப்பநிலையில் எதிர்வினை செய்ய முடியும்.பரிந்துரைக்கப்பட்ட தொகுப்பு நிலைமைகளின் கீழ், ஒலிகோ(dT) ப்ரைமர் மற்றும் [α-P]dCTP இன் 10 μCi ஐப் பயன்படுத்தவும்.முதல் இழையின் மொத்த மகசூல் TCA மழைப்பொழிவு முறையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது.முழு நீள சிடிஎன்ஏ அளவு-வரிசைப்படுத்தப்பட்ட பட்டைகளைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது மற்றும் அல்கலைன் அகரோஸ் ஜெல்லில் கணக்கிடப்பட்டது.

3. தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கு அடைகாக்கும் வெப்பநிலையை உயர்த்தவும்:

அதிக அடைகாக்கும் வெப்பநிலை RNA இரண்டாம் கட்டமைப்பைத் திறக்க உதவுகிறது, எதிர்வினையின் விளைச்சலை அதிகரிக்கிறது.பெரும்பாலான ஆர்என்ஏ டெம்ப்ளேட்டுகளுக்கு, பஃபர் அல்லது உப்பு இல்லாமல் 65 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் ஆர்என்ஏ மற்றும் ப்ரைமர்களை அடைகாப்பது, அதைத் தொடர்ந்து பனியில் விரைவான குளிர்ச்சியானது பெரும்பாலான இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்புகளை அகற்றி, ப்ரைமர்களை பிணைக்க அனுமதிக்கும்.இருப்பினும், சில வார்ப்புருக்கள் இன்னும் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்புகளைக் கொண்டுள்ளன, வெப்பக் குறைபாட்டிற்குப் பிறகும்.இந்த கடினமான டெம்ப்ளேட்களின் பெருக்கம், தெர்மோஸ்கிரிப்ட் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸைப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்படலாம் மற்றும் பெருக்கத்தை மேம்படுத்த, தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் எதிர்வினையை அதிக வெப்பநிலையில் வைக்கலாம்.அதிக அடைகாக்கும் வெப்பநிலைகள் குறிப்பிட்ட தன்மையை அதிகரிக்கலாம், குறிப்பாக சிடிஎன்ஏ தொகுப்புக்கு மரபணு-குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள் (ஜிஎஸ்பி) பயன்படுத்தப்படும் போது (அத்தியாயம் 3 ஐப் பார்க்கவும்).GSP ஐப் பயன்படுத்தினால், ப்ரைமர்களின் Tm எதிர்பார்க்கப்படும் அடைகாக்கும் வெப்பநிலைக்கு சமமாக இருப்பதை உறுதிசெய்யவும்.ஒலிகோ(dT) மற்றும் 60°Cக்கு மேல் ரேண்டம் ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்த வேண்டாம்.ரேண்டம் ப்ரைமர்களுக்கு 60 டிகிரி செல்சியஸ் வரை அதிகரிக்கும் முன் 10 நிமிடங்களுக்கு 25 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் அடைகாக்க வேண்டும்.அதிக ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் வெப்பநிலையைப் பயன்படுத்துவதோடு, ஆர்என்ஏ/ப்ரைமர் கலவையை 65 டிகிரி செல்சியஸ் டினாட்டரேஷன் வெப்பநிலையிலிருந்து ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் இன்குபேஷன் வெப்பநிலைக்கு நேரடியாக மாற்றுவதன் மூலமும், முன்-சூடாக்கப்பட்ட 2× எதிர்வினை கலவையைச் சேர்ப்பதன் மூலமும் (சிடிஎன்ஏ ஹாட்-ஸ்டார்ட் சின்தசிஸ்) குறிப்பிட்ட தன்மையை மேம்படுத்தலாம்.இந்த அணுகுமுறை குறைந்த வெப்பநிலையில் நிகழும் இன்டர்மாலிகுலர் பேஸ் ஜோடியைத் தடுக்க உதவுகிறது.RT-PCRக்கு தேவையான பல வெப்பநிலை மாறுதல்களை வெப்ப சுழற்சியைப் பயன்படுத்தி எளிமைப்படுத்தலாம்.

Tth தெர்மோஸ்டபிள் பாலிமரேஸ் Mg2+ முன்னிலையில் DNA பாலிமரேஸாகவும் Mn2+ முன்னிலையில் RNA பாலிமரேஸாகவும் செயல்படுகிறது.இது அதிகபட்சமாக 65 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் சூடாக வைக்கப்படும்.இருப்பினும், PCR இன் போது Mn2+ இருப்பது நம்பகத்தன்மையைக் குறைக்கிறது, இது சிடிஎன்ஏ குளோனிங் போன்ற உயர்-துல்லியமான பெருக்கத்திற்கு Tth பாலிமரேஸை மிகவும் பொருத்தமற்றதாக ஆக்குகிறது.கூடுதலாக, Tth குறைந்த தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்திறனைக் கொண்டுள்ளது, இது உணர்திறனைக் குறைக்கிறது, மேலும், தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் PCR ஐ ஒற்றை நொதி மூலம் செய்ய முடியும் என்பதால், தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் இல்லாத கட்டுப்பாட்டு எதிர்வினைகள் cDNA பெருக்க தயாரிப்புகளை மாசுபடுத்தும் மரபணு DNA உடன் ஒப்பிட முடியாது.பெருக்க தயாரிப்புகள் பிரிக்கப்பட்டன.

4. தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனை ஊக்குவிக்கும் சேர்க்கைகள்:

கிளிசரால் மற்றும் டிஎம்எஸ்ஓ உள்ளிட்ட சேர்க்கைகள் முதல் இழை தொகுப்பு வினையில் சேர்க்கப்படுகின்றன, இது நியூக்ளிக் அமிலம் இரட்டை இழையின் நிலைத்தன்மையைக் குறைத்து ஆர்என்ஏவின் இரண்டாம் கட்டமைப்பை அவிழ்த்துவிடும்.சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட் II அல்லது MMLV செயல்பாட்டை பாதிக்காமல் 20% கிளிசரால் அல்லது 10% DMSO வரை சேர்க்கலாம்.AMV ஆனது 20% வரை கிளிசரால் செயல்பாட்டை இழக்காமல் பொறுத்துக்கொள்ளும்.சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட்Ⅱ தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் வினையில் RT-PCR இன் உணர்திறனை அதிகரிக்க, 10% கிளிசரால் சேர்க்கப்பட்டு 45°C வெப்பநிலையில் அடைகாக்கப்படும்.பிசிஆரில் 1/10 தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் எதிர்வினை தயாரிப்பு சேர்க்கப்பட்டால், பெருக்க எதிர்வினையில் கிளிசரால் செறிவு 0.4% ஆகும், இது PCR ஐத் தடுக்க போதுமானதாக இல்லை.

5. RNaseH சிகிச்சை:

PCR க்கு முன் RNaseH உடன் சிடிஎன்ஏ தொகுப்பு எதிர்வினைகளுக்கு சிகிச்சையளிப்பது உணர்திறனை அதிகரிக்கும்.சில டெம்ப்ளேட்டுகளுக்கு, சிடிஎன்ஏ தொகுப்பு வினையில் ஆர்என்ஏ பெருக்க தயாரிப்புகளை பிணைப்பதைத் தடுக்கிறது என்று கருதப்படுகிறது, இதில் RNaseH சிகிச்சையானது உணர்திறனை அதிகரிக்கும்.பொதுவாக, குறைந்த நகல் டியூபரஸ் ஸ்கெரோசிஸ் II போன்ற நீண்ட முழு நீள சிடிஎன்ஏ இலக்கு டெம்ப்ளேட்களைப் பெருக்கும் போது RNaseH சிகிச்சை அவசியம்.இந்த கடினமான டெம்ப்ளேட்டிற்கு, சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட் II அல்லது AMV-ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட சிடிஎன்ஏ மூலம் உருவாக்கப்பட்ட சிக்னலை RNaseH சிகிச்சை மேம்படுத்தியது.பெரும்பாலான RT-PCR எதிர்வினைகளுக்கு, RNaseH சிகிச்சை விருப்பமானது, ஏனெனில் 95°C இல் உள்ள PCR denaturation படி பொதுவாக RNA:DNA வளாகத்தில் RNA ஐ ஹைட்ரோலைஸ் செய்கிறது.

6. சிறிய RNA கண்டறிதல் முறையின் மேம்பாடு:

ஆர்டி-பிசிஆர் குறிப்பாக சிறிய அளவிலான ஆர்என்ஏ கிடைக்கும் போது சவாலானது.ஆர்என்ஏ தனிமைப்படுத்தலின் போது ஒரு கேரியராக சேர்க்கப்படும் கிளைகோஜன் சிறிய மாதிரிகளின் விளைச்சலை அதிகரிக்க உதவுகிறது.ட்ரைசோலைச் சேர்ப்பதுடன் RNase-இலவச கிளைகோஜனையும் சேர்க்கலாம்.கிளைகோஜன் நீரில் கரையக்கூடியது மற்றும் ஆர்.என்.ஏ உடன் நீர் நிலையில் வைத்து அடுத்தடுத்த மழைப்பொழிவுக்கு உதவலாம்.50 மில்லிகிராம் திசு அல்லது 106 வளர்ப்பு உயிரணுக்களுக்கு குறைவான மாதிரிகளுக்கு, RNase-இலவச கிளைகோஜனின் பரிந்துரைக்கப்பட்ட செறிவு 250 μg/ml ஆகும்.

சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட் II ஐப் பயன்படுத்தி தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் எதிர்வினைக்கு அசிடைலேட்டட் பிஎஸ்ஏவைச் சேர்ப்பது உணர்திறனை அதிகரிக்கலாம், மேலும் சிறிய அளவிலான ஆர்என்ஏவுக்கு, சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட் II இன் அளவைக் குறைத்து, 40 யூனிட் ஆர்நேஸ்அவுட் நியூக்லீஸ் இன்ஹிபிட்டரைச் சேர்ப்பது கண்டறியும் அளவை அதிகரிக்கலாம்.ஆர்என்ஏ தனிமைப்படுத்தும் செயல்பாட்டில் கிளைகோஜன் பயன்படுத்தப்பட்டால், தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் எதிர்வினைக்கு சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட் II ஐப் பயன்படுத்தும் போது BSA அல்லது RNase இன்ஹிபிட்டரைச் சேர்க்க பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

RT-PCR விவரக்குறிப்பை அதிகரிக்கவும்

1. CND ஒத்திசைவு:

முதல்-ஸ்ட்ராண்ட் சிடிஎன்ஏ தொகுப்பு மூன்று வெவ்வேறு முறைகளைப் பயன்படுத்தி தொடங்கப்படலாம், இது சிடிஎன்ஏவின் அளவு மற்றும் வகையை பாதிக்கிறது.

மூன்று முறைகளில் ரேண்டம் ப்ரைமர் முறை மிகக் குறைவானது.ப்ரைமர்கள் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் முழுவதும் பல தளங்களில் இணைக்கப்பட்டு, குறுகிய, பகுதி-நீள சிடிஎன்ஏக்களை உருவாக்குகின்றன.இந்த முறை 5′ இறுதி வரிசைகளைப் பெறவும், இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பின் பகுதிகள் அல்லது ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸால் நகலெடுக்க முடியாத டெர்மினேஷன் தளங்களைக் கொண்ட RNA வார்ப்புருக்களிலிருந்து cDNA ஐப் பெறவும் அடிக்கடி பயன்படுத்தப்படுகிறது.மிக நீளமான சிடிஎன்ஏவைப் பெற, ஒவ்வொரு ஆர்என்ஏ மாதிரியிலும் ப்ரைமர்களின் ஆர்என்ஏ விகிதத்தை அனுபவ ரீதியாக தீர்மானிக்க வேண்டும்.சீரற்ற ப்ரைமர்களின் ஆரம்ப செறிவு 20 μl எதிர்வினைக்கு 50 முதல் 250 ng வரை இருக்கும்.ரேண்டம் ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி மொத்த ஆர்என்ஏவிலிருந்து சிடிஎன்ஏ ஒருங்கிணைக்கப்படுவது முதன்மையாக ரைபோசோமால் ஆர்என்ஏவாக இருப்பதால், பாலி(ஏ)+ஆர்என்ஏ பொதுவாக டெம்ப்ளேட்டாகத் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகிறது.

ஒலிகோ(dT) ப்ரைமர்கள் ரேண்டம் ப்ரைமர்களை விட குறிப்பிட்டவை.இது பெரும்பாலான யூகாரியோடிக் எம்ஆர்என்ஏக்களின் 3′ முடிவில் காணப்படும் பாலி(ஏ) வால் வரை கலப்பினமாக்குகிறது.பாலி(A)+ ஆர்என்ஏ மொத்த ஆர்என்ஏவில் தோராயமாக 1% முதல் 2% வரை இருப்பதால், சிடிஎன்ஏவின் அளவு மற்றும் சிக்கலானது சீரற்ற ப்ரைமர்களைக் காட்டிலும் மிகக் குறைவு.அதன் அதிக விவரக்குறிப்பு காரணமாக, ஒலிகோ(dT) க்கு பொதுவாக ஆர்என்ஏ மற்றும் ப்ரைமர்கள் மற்றும் பாலி(A)+ தேர்வு ஆகியவற்றின் விகிதத்தை மேம்படுத்த வேண்டிய அவசியமில்லை.20μl எதிர்வினை அமைப்புக்கு 0.5μg ஒலிகோ(dT) பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.ஒலிகோ(dT)12-18 பெரும்பாலான RT-PCRக்கு ஏற்றது.தெர்மோஸ்கிரிப்ட் ஆர்டி-பிசிஆர் சிஸ்டம் ஒலிகோ(டிடி)20ஐ வழங்குகிறது, ஏனெனில் அதிக அடைகாக்கும் வெப்பநிலையில் அதன் சிறந்த வெப்ப நிலைத்தன்மை உள்ளது.

மரபணு குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள் (GSP) என்பது தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் படிக்கான மிகவும் குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள் ஆகும்.ஜிஎஸ்பி என்பது ஒரு ஆன்டிசென்ஸ் ஒலிகோநியூக்ளியோடைடு ஆகும், இது அனைத்து ஆர்என்ஏக்களையும் இணைக்கும் ரேண்டம் ப்ரைமர்கள் அல்லது ஒலிகோ(டிடி) போலல்லாமல், ஆர்என்ஏ இலக்கு வரிசைக்கு குறிப்பாக கலப்பினமாக்கும்.பிசிஆர் ப்ரைமர்களை வடிவமைக்கப் பயன்படுத்தப்படும் அதே விதிகள், தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் எதிர்வினைகளில் ஜிஎஸ்பி வடிவமைப்பிற்கும் பொருந்தும்.எம்ஆர்என்ஏவின் 3′-அதிக முனைக்கு இணைக்கும் பெருக்க ப்ரைமரின் அதே வரிசையாக ஜிஎஸ்பி இருக்கலாம் அல்லது ஜிஎஸ்பியானது ரிவர்ஸ் ஆம்ப்ளிஃபிகேஷன் ப்ரைமரின் கீழ்நிலையை இணைக்கும் வகையில் வடிவமைக்கப்படலாம்.சில பெருக்கப்பட்ட பாடங்களுக்கு, ஒன்றுக்கு மேற்பட்ட ஆன்டிசென்ஸ் ப்ரைமர்கள் வெற்றிகரமான RT-PCRக்காக வடிவமைக்கப்பட வேண்டும், ஏனெனில் இலக்கு RNAயின் இரண்டாம் நிலை அமைப்பு ப்ரைமர் பிணைப்பைத் தடுக்கலாம்.20 μl முதல் இழை தொகுப்பு எதிர்வினையில் 1 pmol ஆன்டிசென்ஸ் GSP ஐப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

2. தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கு அடைகாக்கும் வெப்பநிலையை உயர்த்தவும்:

GSP விவரக்குறிப்பின் முழு நன்மையையும் முழுமையாகப் பயன்படுத்த, அதிக தெர்மோஸ்டபிலிட்டியுடன் கூடிய தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் பயன்படுத்தப்பட வேண்டும்.தெர்மோஸ்டபிள் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ்கள் எதிர்வினைக் கடினத்தன்மையை அதிகரிக்க அதிக வெப்பநிலையில் அடைகாக்கப்படலாம்.எடுத்துக்காட்டாக, ஒரு GSP ஆனது 55°C இல் இருந்தால், AMV அல்லது M-MLV 37°C என்ற குறைந்த அழுத்தத்தில் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டால், GSPயின் தனித்தன்மை முழுமையாகப் பயன்படுத்தப்படாது.இருப்பினும், சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட் II மற்றும் தெர்மோஸ்கிரிப்ட் 50 டிகிரி செல்சியஸ் அல்லது அதற்கும் அதிகமான வெப்பநிலையில் வினைபுரியலாம், இது குறைந்த வெப்பநிலையில் உருவாக்கப்படும் குறிப்பிட்ட தயாரிப்புகளை அகற்றும்.அதிகபட்ச விவரக்குறிப்புக்கு, ஆர்என்ஏ/பிரைமர் கலவையை 65 டிகிரி செல்சியஸ் டினாட்டரேஷன் வெப்பநிலையில் இருந்து நேரடியாக ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் இன்குபேஷன் வெப்பநிலைக்கு மாற்றலாம் மற்றும் முன்-சூடாக்கப்பட்ட 2× எதிர்வினை கலவையில் (சிடிஎன்ஏ தொகுப்பு ஹாட் ஸ்டார்ட்) சேர்க்கலாம்.இது குறைந்த வெப்பநிலையில் மூலக்கூறு அடிப்படை இணைவதைத் தடுக்க உதவுகிறது.RT-PCRக்கு தேவையான பல வெப்பநிலை மாற்றங்களை வெப்ப சுழற்சியைப் பயன்படுத்தி எளிமைப்படுத்தலாம்.

3. மரபணு டிஎன்ஏ மாசுபாட்டைக் குறைக்கிறது

ஆர்டி-பிசிஆர் உடன் எதிர்கொள்ளும் ஒரு சாத்தியமான சிரமம் ஆர்என்ஏவில் உள்ள மரபணு டிஎன்ஏவின் மாசுபாடு ஆகும்.டிரைசோல் ரீஜென்ட் போன்ற ஒரு நல்ல ஆர்என்ஏ தனிமைப்படுத்தும் முறையைப் பயன்படுத்துவது, ஆர்என்ஏ தயாரிப்பில் மாசுபடுத்தும் மரபணு டிஎன்ஏவின் அளவைக் குறைக்கும்.ஜெனோமிக் டிஎன்ஏவில் இருந்து பெறப்பட்ட தயாரிப்புகளைத் தவிர்க்க, ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கு முன் மாசுபடுத்தும் டிஎன்ஏவை அகற்றுவதற்காக ஆர்என்ஏவை பெருக்க-தர DNase I உடன் சிகிச்சையளிக்கலாம்.DNase I செரிமானம் 2.0 mM EDTA இல் 10 நிமிடங்களுக்கு 65 ° C இல் அடைகாப்பதன் மூலம் நிறுத்தப்பட்டது.EDTA ஆனது மெக்னீசியம் அயனிகளை செலேட் செய்து, அதிக வெப்பநிலையில் மெக்னீசியம் அயனி சார்ந்த RNA நீராற்பகுப்பைத் தடுக்கிறது.

மாசுபடுத்தும் மரபணு டிஎன்ஏ பெருக்க தயாரிப்புகளிலிருந்து பெருக்கப்பட்ட சிடிஎன்ஏவைப் பிரிக்க, ப்ரைமர்கள் ஒவ்வொன்றும் தனித்தனி எக்ஸான்களாக வடிவமைக்கப்படலாம்.சிடிஎன்ஏவில் இருந்து பெறப்பட்ட பிசிஆர் தயாரிப்புகள் அசுத்தமான மரபணு டிஎன்ஏவில் இருந்து பெறப்பட்டதை விட குறைவாக இருக்கும்.கூடுதலாக, ஒவ்வொரு ஆர்என்ஏ டெம்ப்ளேட்டிலும் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் இல்லாமல் ஒரு கட்டுப்பாட்டு பரிசோதனை செய்யப்பட்டது, கொடுக்கப்பட்ட துண்டு மரபணு டிஎன்ஏ அல்லது சிடிஎன்ஏவில் இருந்து பெறப்பட்டதா என்பதை தீர்மானிக்க.தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் இல்லாமல் பெறப்பட்ட PCR தயாரிப்பு மரபணுவிலிருந்து பெறப்பட்டது.