எல்லோரும் qRT-PCR பரிசோதனையின் கொள்கை, முதன்மை வடிவமைப்பு, முடிவு விளக்கம் போன்றவற்றைப் பற்றி பேசுகிறார்கள், ஆனால் qRT-PCR இன் சோதனை செயல்பாட்டை உங்களுடன் பகிர்ந்து கொள்ள வேண்டும் என்று நினைக்கிறேன்.இது சிறியது, ஆனால் இது முடிவுகளைப் பற்றியது.
qRT-PCR செய்வதற்கு முன், நம்முடைய சொந்த RNA மற்றும் செயல்பாட்டு முறைகள் பற்றிய தெளிவான புரிதல் நமக்கு இருக்க வேண்டும்.எல்லாவற்றிற்கும் மேலாக, எங்கள் முயற்சிகள் வெறுமனே பயிற்சி செய்வதை விட முடிவுகளைப் பெறுவதை நோக்கமாகக் கொண்டுள்ளன.எனவே qRT-PCR செய்வதற்கு முன், பின்வரும் சிக்கல்களை நாம் தீர்மானிக்க வேண்டும் (அவற்றில் சில SYBR க்கு மட்டுமே பொருந்தும்).
1 உங்கள் ஆர்என்ஏ சிதைக்கப்படவில்லை என்பதில் உறுதியாக இருக்கிறீர்களா?
நானோ டிராப் 2000 ஆர்என்ஏவின் செறிவு மற்றும் தூய்மையை மட்டுமே கண்டறிய முடியும், ஆனால் ஆர்என்ஏவின் ஒருமைப்பாட்டை கண்டறிய முடியாது.
ஆர்என்ஏ (ஆர்என்ஏ இன்டெசிட்டி எண்) மதிப்பு ஆர்என்ஏவின் ஒருமைப்பாட்டை பிரதிபலிக்கும், இது அஜிலன்ட் 2100 பயோஅனாலைசர் அமைப்பு மூலம் கண்டறியப்படுகிறது.
படம். வெவ்வேறு RNA மாதிரிகளுக்கான RIN மதிப்புகளின் திட்ட வரைபடம் (யூகாரியோட்டுகள்)
இருப்பினும், ஆய்வகங்களில் பொதுவாக Agilent 2100 Bioanalyzer இல்லை.இந்த வழக்கில், ஃபார்மால்டிஹைட் ஜெல் மூலம் நாம் கண்டறிய முடியும், ஆனால் மொத்த ஆர்என்ஏ அளவுக்கான தேவை அதிகமாக உள்ளது, எனவே சாதாரண ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸைப் பயன்படுத்துவது வேகமான முறையாகும்.இது அணுக்கரு இல்லாத சூழலில் இருக்க வேண்டும், எனவே எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் தொட்டி, சோல் பாட்டில், ஜெல் அடைப்புக்குறி மற்றும் சீப்பு ஆகியவற்றை DEPC தண்ணீரில் துவைக்க வேண்டியது அவசியம்.அகரோஸ் அணுக்கரு இல்லாதது (புதிதாகத் திறக்கப்படும் வரை), மேலும் ஏற்றுதல் இடையகமானது 1.2% ஜெல் மூலம் முடிந்தவரை புதிதாகத் திறக்கப்பட வேண்டும்.
படத்தில் உள்ள மாதிரி 9 இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, ஜெல் முற்றிலும் கரைக்கப்பட வேண்டும் என்பதை நினைவில் கொள்க, இல்லையெனில் அது ஒத்திசைவற்ற பட்டைகளை ஏற்படுத்தும்.மின்னழுத்தம் அதிகமாக இருந்தால் அல்லது அதிக நேரம் இயங்கினால் வெப்பத்தை உருவாக்கி ஆர்என்ஏ சிதைவை ஏற்படுத்தும், எனவே மின்னழுத்தம் மற்றும் நேரத்தை நியாயமான முறையில் கட்டுப்படுத்த வேண்டும்.கூடுதலாக, ஜெல் ஓட்டம் மாதிரியில் டிஎன்ஏ எச்சம் உள்ளதா என்பதை மேலும் தீர்மானிக்க முடியும், மேலும் விநியோகிக்கும் கிணற்றில் அதிக எண்ணிக்கையிலான தக்கவைக்கப்பட்ட பட்டைகள் உள்ளதா என்பதைக் கண்காணிக்கலாம்.
படம்.RNA இன் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் கண்டறிதல்
2 உங்கள் சிடிஎன்ஏவின் செறிவு குறித்து உறுதியாக இருக்கிறீர்களா?
ஆய்வகத்தில் உள்ள பெரிய சகோதரர்களின் அனுபவம் என்னவென்றால், ஒவ்வொரு தலைகீழ் முறையிலும் பெறப்பட்ட 20 ul அமைப்பின் cDNA நேரடியாக 20X நீர்த்தப்படுகிறது, அதே நேரத்தில் முனைவர் பட்டத்திற்குப் பிறகு சகோதரிகள் 10X நீர்த்தப்படுகிறார்கள்.நான் பொதுவாக நிலைமையைப் பொறுத்தது.ஒவ்வொரு நபரும் குறிப்பிடும் ஆர்என்ஏவின் தரம் வித்தியாசமாக இருப்பதால், தலைகீழ் நிலையும் வேறுபட்டது, மேலும் தலைகீழ் தொழில்நுட்பம் நிலையானதாக இருக்காது.
எனவே ஒவ்வொரு முறையும் நான் தலைகீழான சிடிஎன்ஏவைப் பெறும்போது, நான் முதலில் அதை சுமார் 3 முறை நீர்த்துப்போகச் செய்வேன், பின்னர் RT-PCR செய்ய ஹவுஸ் கீப்பிங் மரபணுவைப் பயன்படுத்துவேன், சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை பொதுவாக 25 சுழற்சிகள், குறிப்பிட்ட செறிவைக் கண்டறிந்து, பின்னர் இறுதி நீர்த்த காரணியைத் தீர்மானிப்பேன்.
3 உங்கள் ப்ரைமர்கள் பயன்படுத்த எளிதானது என்பதில் உறுதியாக இருக்கிறீர்களா?
இது qRT-PCR இன் உருகும் வளைவைக் கடக்க முடியும், ஆனால் இதற்கு இன்னும் பணம் செலவாகும்.அதிக பணம் இல்லாத ஆய்வகங்களுக்கு, அதிக ப்ரைமர்கள் கிடைக்கும்போது, சாதாரண RT-PCR ஐப் பயன்படுத்தி, அது ஒற்றை இசைக்குழுவாக உள்ளதா என்பதைப் பார்த்து, ப்ரைமர்களின் தனித்தன்மையைக் கண்டறியலாம்.ஆய்வகம் பணம் குறைவாக இல்லை என்றால், அனைத்து ப்ரைமர்களின் தனித்தன்மையை உருகும் வளைவு மூலம் ஒரு முறை அடையாளம் காண முடியும்.
4 உங்கள் சோதனை நிலைமைகள் பொருத்தமானவை என்று உறுதியாக உள்ளீர்களா?
SYBR வலுவான ஒளியில் இருந்து பாதுகாக்கப்பட வேண்டும், எனவே SYBR ரீஜென்டைச் சேர்க்கும் போது மேல்நிலை விளக்கை அணைக்க முயற்சிக்கவும், அதை முடிக்க மங்கலான ஒளியை மட்டுமே பயன்படுத்த வேண்டும்.
SYBR ஐ 4°C வெப்பநிலையில் சேமிக்கவும்.உபயோகத்தில் இருக்கும்போது, நுரை வராமல் இருக்க நன்றாகக் கலக்க, மேலும் வலுவாக சுழல வேண்டாம்.
சில இளைய சகோதரிகள் மாதிரிகளை கலக்க பயந்து PCR போர்டில் மதிப்பெண்களை வரைய விரும்புகிறார்கள், இது தவறு.உங்கள் குறிப்பான்கள் ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னல்களின் சேகரிப்பைப் பாதிக்கும் என்பதால், கீழே காட்டப்பட்டுள்ளபடி, நினைவகத்தில் உதவுவதற்காக சோதனைக் குறிப்பேடுகளைப் பயன்படுத்த ஜூனியர்களுக்கு பொதுவாக பரிந்துரைக்கிறேன்.
படம்.qRT-PCR மாதிரி ஏற்றுதல் வரைபடம்
5 நீங்கள் அதைச் சரியாகச் செய்கிறீர்களா?
கையுறைகளை அணியவும், கையுறைகளை அணியவும், கையுறைகளை அணியவும், முக்கியமான விஷயங்களை மூன்று முறை கூறவும்.
SYBR ஒளியின் வெளிப்பாட்டைக் குறைக்க, கீழே உள்ள படத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளபடி முதலில் ஒரு டெம்ப்ளேட்டைச் சேர்க்க நான் தனிப்பட்ட முறையில் விரும்புகிறேன்.அனுபவத்தின்படி, ஒரு சிறிய அளவு டெம்ப்ளேட்டைச் சேர்ப்பது மாதிரி பிழைகளை ஏற்படுத்தக்கூடும்.எனவே, சிறிய அளவிலான டெம்ப்ளேட்டைச் சேர்ப்பதால் ஏற்படும் பிழையைக் குறைக்க, நான் வழக்கமாக மாதிரியை மீண்டும் இரட்டிப்பாக்குவேன், மேலும் H2O2 இன் அளவைக் குறைக்க மாதிரியைச் சேர்க்கும்போது அளவை இரட்டிப்பாக்குவேன்.
படம்.qRT-PCR ஏற்றுதலின் திட்ட வரைபடம்
பின் qRT-PCR அமைப்பை பின்வருமாறு கட்டமைக்கவும்.
படம்.qRT-PCR அமைப்பு தயாரிப்பு வரைபடம்
குறிப்பு: உள்ளமைவு செயல்முறை பனியில் செய்யப்பட வேண்டும்.
மாதிரியைச் சேர்த்த பிறகு, வெளிப்படையான சீல் படத்தை ஒட்டவும்.உங்கள் கைகளால் வெளிப்படையான சீல் படத்தின் மேற்பரப்பைத் தொடாமல் இருக்க முயற்சி செய்யுங்கள், படத்தின் இருபுறமும் உள்ள இடத்தில் இருந்து செயல்படுங்கள்.ஏனெனில் கைரேகைகள் ஒளிரும் சமிக்ஞைகளின் சேகரிப்பையும் பாதிக்கலாம்.மாதிரியானது சுவரில் தொங்குவதைத் தடுக்க, குறைந்த வேகத்தில் 10 வினாடிகளுக்கு விரைவாக மையவிலக்கு செய்ய ஒரு மையவிலக்கைப் பயன்படுத்தவும்.
தொடர்புடைய தயாரிப்புகள்:
பின் நேரம்: ஏப்-28-2023
