PCR (பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினை) என்பது 30 ஆண்டுகளுக்கும் மேலான வரலாற்றைக் கொண்ட இன்-விட்ரோ டிஎன்ஏ பெருக்க தொழில்நுட்பங்களில் ஒன்றாகும்.

PCR தொழில்நுட்பம் 1983 இல் Cetus, USA இன் கேரி முல்லிஸால் முன்னோடியாக இருந்தது. முல்லிஸ் 1985 இல் PCR காப்புரிமைக்கு விண்ணப்பித்தார் மற்றும் அதே ஆண்டில் அறிவியல் பற்றிய முதல் PCR கல்விக் கட்டுரையை வெளியிட்டார்.முல்லிஸ் தனது பணிக்காக 1993 இல் வேதியியலுக்கான நோபல் பரிசு பெற்றார்.

PCR இன் அடிப்படைக் கோட்பாடுகள்

PCR இலக்கு டிஎன்ஏ துண்டுகளை ஒரு மில்லியனுக்கும் அதிகமான மடங்கு அதிகரிக்க முடியும்.கொள்கையானது டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் வினையூக்கத்தின் கீழ் உள்ளது, பெற்றோர் இழை டிஎன்ஏவை டெம்ப்ளேட்டாகவும், குறிப்பிட்ட ப்ரைமரை நீட்டிப்புக்கான தொடக்க புள்ளியாகவும் பயன்படுத்துகிறது.இது denaturation, annealing, and extension போன்ற படிகள் மூலம் விட்ரோவில் நகலெடுக்கப்படுகிறது.மகள் ஸ்ட்ராண்ட் டிஎன்ஏவின் செயல்முறை பெற்றோர் இழை டெம்ப்ளேட் டிஎன்ஏ உடன் நிரப்புகிறது.

நிலையான PCR செயல்முறை மூன்று படிகளாக பிரிக்கப்பட்டுள்ளது:

1.Denaturation: DNA இரட்டை இழைகளைப் பிரிக்க அதிக வெப்பநிலையைப் பயன்படுத்தவும்.DNA இரட்டை இழைகளுக்கு இடையிலான ஹைட்ரஜன் பிணைப்பு அதிக வெப்பநிலையில் (93-98℃) உடைக்கப்படுகிறது.

2.அனீலிங்: இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏ பிரிக்கப்பட்ட பிறகு, வெப்பநிலையை குறைக்கவும், இதனால் ப்ரைமர் ஒற்றை இழை DNA உடன் பிணைக்க முடியும்.

3.நீட்டிப்பு: டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ், வெப்பநிலை குறைக்கப்படும்போது பிணைக்கப்பட்ட ப்ரைமர்களில் இருந்து டிஎன்ஏ இழைகளுடன் நிரப்பு இழைகளை ஒருங்கிணைக்கத் தொடங்குகிறது.நீட்டிப்பு முடிந்ததும், ஒரு சுழற்சி நிறைவடைகிறது, மேலும் டிஎன்ஏ துண்டுகளின் எண்ணிக்கை இரட்டிப்பாகும்

இந்த மூன்று படிகளை 25-35 முறை திருப்பிச் செலுத்தினால், டிஎன்ஏ துண்டுகளின் எண்ணிக்கை அதிவேகமாக அதிகரிக்கும்.

PCR இன் புத்திசாலித்தனம் என்னவென்றால், வெவ்வேறு இலக்கு மரபணுக்களுக்காக வெவ்வேறு ப்ரைமர்களை வடிவமைக்க முடியும், இதனால் இலக்கு மரபணு துண்டுகளை குறுகிய காலத்தில் பெருக்க முடியும்.

இதுவரை, PCR ஐ சாதாரண PCR, fluorescent quantitative PCR மற்றும் டிஜிட்டல் PCR என மூன்று வகைகளாகப் பிரிக்கலாம்.

சாதாரண PCR இன் முதல் தலைமுறை

இலக்கு மரபணுவைப் பெருக்க ஒரு சாதாரண PCR பெருக்க கருவியைப் பயன்படுத்தவும், பின்னர் தயாரிப்பைக் கண்டறிய அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸைப் பயன்படுத்தவும், தரமான பகுப்பாய்வு மட்டுமே செய்ய முடியும்.

முதல் தலைமுறை PCR இன் முக்கிய தீமைகள்:

1.குறிப்பிடாத பெருக்கம் மற்றும் தவறான நேர்மறை முடிவுகளுக்கு வாய்ப்புள்ளது.

2. கண்டறிதல் நீண்ட நேரம் எடுக்கும் மற்றும் அறுவை சிகிச்சை சிக்கலானது.

3. தரமான சோதனை மட்டுமே செய்ய முடியும்

இரண்டாம் தலைமுறை நிகழ்நேர பிசிஆர்

நிகழ்நேர PCR, qPCR என்றும் அழைக்கப்படுகிறது, இது எதிர்வினை அமைப்பின் முன்னேற்றத்தைக் குறிக்கும் ஒளிரும் ஆய்வுகளைப் பயன்படுத்துகிறது, மேலும் ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னல்களின் திரட்சியின் மூலம் பெருக்கப்பட்ட தயாரிப்புகளின் திரட்சியைக் கண்காணிக்கிறது மற்றும் ஃப்ளோரசன்ஸ் வளைவு மூலம் முடிவுகளை தீர்மானிக்கிறது.இது Cq மதிப்பு மற்றும் நிலையான வளைவின் உதவியுடன் அளவிடப்படலாம்.

qPCR தொழில்நுட்பம் ஒரு மூடிய அமைப்பில் மேற்கொள்ளப்படுவதால், மாசுபடுவதற்கான நிகழ்தகவு குறைகிறது, மேலும் ஃப்ளோரசன் சிக்னலை அளவு கண்டறிதலுக்காக கண்காணிக்க முடியும், எனவே இது மருத்துவ நடைமுறையில் மிகவும் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது மற்றும் PCR இல் ஆதிக்கம் செலுத்தும் தொழில்நுட்பமாக மாறியுள்ளது.

நிகழ்நேர ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR இல் பயன்படுத்தப்படும் ஒளிரும் பொருட்களைப் பிரிக்கலாம்: TaqMan ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வு, மூலக்கூறு பீக்கான்கள் மற்றும் ஃப்ளோரசன்ட் சாயம்.

1) TaqMan ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வு:

PCR பெருக்கத்தின் போது, ​​ஒரு ஜோடி ப்ரைமரைச் சேர்க்கும்போது ஒரு குறிப்பிட்ட ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வு சேர்க்கப்படுகிறது.ஆய்வு ஒரு ஒலிகோநியூக்ளியோடைடு ஆகும், மேலும் இரு முனைகளும் ஒரு நிருபர் ஃப்ளோரசன்ட் குழு மற்றும் ஒரு க்வென்சர் ஃப்ளோரசன்ட் குழுவுடன் பெயரிடப்பட்டுள்ளன.

ஆய்வு அப்படியே இருக்கும் போது, ​​நிருபர் குழுவால் வெளியிடப்படும் ஒளிரும் சிக்னல் தணிக்கும் குழுவால் உறிஞ்சப்படுகிறது;PCR பெருக்கத்தின் போது, ​​Taq நொதியின் 5′-3′ exonuclease செயல்பாடு, ஆய்வை பிளவுபடுத்துகிறது மற்றும் சிதைக்கிறது, இது நிருபர் ஃப்ளோரசன்ட் குழுவாகவும், ஃப்ளோரசன்ட் குழுவாகவும் பிரிக்கப்படுகிறது, இதனால் ஃப்ளோரசன்ஸ் கண்காணிப்பு அமைப்பு ஃப்ளோரசன்ஸ் சிக்னலைப் பெறுகிறது, அதாவது ஒவ்வொரு முறையும் ஒரு ஒளிரும் ஒளிமயமாக உருவாகிறது. ஃப்ளோரசன்ஸ் சிக்னலின் லேஷன் பிசிஆர் தயாரிப்பின் உருவாக்கத்துடன் முழுமையாக ஒத்திசைக்கப்படுகிறது.

2) SYBR ஃப்ளோரசன்ட் சாயம்:

PCR எதிர்வினை அமைப்பில், SYBR ஃப்ளோரசன்ட் சாயம் அதிகமாக சேர்க்கப்படுகிறது.SYBR ஃப்ளோரசன்ட் சாயம் டிஎன்ஏ இரட்டை இழையில் குறிப்பாக இணைக்கப்படாத பிறகு, அது ஒரு ஒளிரும் சமிக்ஞையை வெளியிடுகிறது.சங்கிலியில் இணைக்கப்படாத SYBR சாய மூலக்கூறு எந்த ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னலையும் வெளியிடாது, அதன் மூலம் ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னலை உறுதி செய்கிறது PCR தயாரிப்புகளின் அதிகரிப்பு PCR தயாரிப்புகளின் அதிகரிப்புடன் முழுமையாக ஒத்திசைக்கப்படுகிறது.SYBR ஆனது இரட்டை இழையுடைய DNA உடன் மட்டுமே பிணைக்கிறது, எனவே PCR எதிர்வினை குறிப்பிட்டதா என்பதை தீர்மானிக்க உருகும் வளைவைப் பயன்படுத்தலாம்.

3) மூலக்கூறு கலங்கரை விளக்கம்:

இது ஒரு ஸ்டெம்-லூப் இரட்டை-லேபிளிடப்பட்ட ஒலிகோநியூக்ளியோடைடு ஆய்வு ஆகும், இது 5 மற்றும் 3 முனைகளில் சுமார் 8 தளங்களின் ஹேர்பின் அமைப்பை உருவாக்குகிறது.இரு முனைகளிலும் உள்ள நியூக்ளிக் அமில வரிசைகள் இணையாக இணைகின்றன, இதனால் ஃப்ளோரசன்ட் குழு மற்றும் தணிக்கும் குழு இறுக்கமாக இருக்கும்.நெருக்கமாக, எந்த ஒளிரும் உற்பத்தி செய்யப்படாது.

பிசிஆர் தயாரிப்பு உருவாக்கப்பட்ட பிறகு, அனீலிங் செயல்பாட்டின் போது, ​​மூலக்கூறு கலங்கரை விளக்கின் நடுப்பகுதி ஒரு குறிப்பிட்ட டிஎன்ஏ வரிசையுடன் இணைக்கப்படுகிறது, மேலும் ஃப்ளோரசன்ட் மரபணுவை தணிக்கும் மரபணுவிலிருந்து பிரிக்கப்பட்டு ஒளிரும் தன்மையை உருவாக்குகிறது.

இரண்டாம் தலைமுறை PCR இன் முக்கிய தீமைகள்:

உணர்திறன் இன்னும் குறைவாக உள்ளது, மேலும் குறைந்த நகல் மாதிரிகளைக் கண்டறிவது தவறானது.

பின்னணி மதிப்பின் செல்வாக்கு உள்ளது, இதன் விளைவாக குறுக்கீடுகள் ஏற்படுகின்றன.

எதிர்வினை அமைப்பில் PCR தடுப்பான்கள் இருக்கும்போது, ​​கண்டறிதல் முடிவுகள் குறுக்கீட்டிற்கு ஆளாகின்றன.

மூன்றாம் தலைமுறை டிஜிட்டல் பிசிஆர்

டிஜிட்டல் PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) இலக்கு வரிசையின் நகல் எண்ணை எண்ட்-பாயின்ட் கண்டறிதல் மூலம் கணக்கிடுகிறது, மேலும் உள் கட்டுப்பாடுகள் மற்றும் நிலையான வளைவுகளைப் பயன்படுத்தாமல் துல்லியமான முழுமையான அளவு கண்டறிதலைச் செய்ய முடியும்.

டிஜிட்டல் PCR இறுதி-புள்ளி கண்டறிதலைப் பயன்படுத்துகிறது மற்றும் Ct மதிப்பை (சுழற்சி த்ரெஷோல்ட்) சார்ந்து இருக்காது, எனவே டிஜிட்டல் PCR எதிர்வினை பெருக்க செயல்திறனால் குறைவாக பாதிக்கப்படுகிறது, மேலும் PCR எதிர்வினை தடுப்பான்களுக்கான சகிப்புத்தன்மை உயர் துல்லியம் மற்றும் மறுஉருவாக்கம் மேம்படுத்தப்பட்டுள்ளது.

அதிக உணர்திறன் மற்றும் அதிக துல்லியத்தின் பண்புகள் காரணமாக, இது PCR எதிர்வினை தடுப்பான்களால் எளிதில் குறுக்கிடப்படாது, மேலும் இது நிலையான தயாரிப்புகள் இல்லாமல் உண்மையான முழுமையான அளவை அடைய முடியும், இது ஒரு ஆராய்ச்சி மற்றும் பயன்பாட்டு ஹாட்ஸ்பாடாக மாறியுள்ளது.

எதிர்வினை அலகின் வெவ்வேறு வடிவங்களின்படி, அதை மூன்று முக்கிய வகைகளாகப் பிரிக்கலாம்: மைக்ரோஃப்ளூய்டிக், சிப் மற்றும் துளி அமைப்புகள்.

1) மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் டிஜிட்டல் PCR, mdPCR:

மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் தொழில்நுட்பத்தின் அடிப்படையில், டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட் பிரிக்கப்பட்டுள்ளது.மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் தொழில்நுட்பம் மாதிரி நானோ-மேம்படுத்துதல் அல்லது சிறிய நீர்த்துளிகளின் உருவாக்கத்தை உணர முடியும், ஆனால் நீர்த்துளிகளுக்கு ஒரு சிறப்பு உறிஞ்சுதல் முறை தேவைப்படுகிறது, பின்னர் PCR எதிர்வினை அமைப்புடன் இணைக்கப்படுகிறது.mdPCR படிப்படியாக மற்ற முறைகள் பதிலாக ஏற்றுக்கொள்ளப்பட்டது.

2) துளி அடிப்படையிலான டிஜிட்டல் PCR, ddPCR:

மாதிரியை துளிகளாகச் செயலாக்குவதற்கு நீரில்-எண்ணெய் துளி உருவாக்கும் தொழில்நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தவும், மேலும் நியூக்ளிக் அமில மூலக்கூறுகளைக் கொண்ட எதிர்வினை அமைப்பை ஆயிரக்கணக்கான நானோ அளவிலான துளிகளாகப் பிரிக்கவும், ஒவ்வொன்றும் நியூக்ளிக் அமில இலக்கு மூலக்கூறைக் கொண்டிருக்கவில்லை அல்லது சோதிக்கப்பட வேண்டிய ஒன்று முதல் பல நியூக்ளிக் அமில இலக்கு மூலக்கூறுகளைக் கொண்டுள்ளது.

3) சிப் அடிப்படையிலான டிஜிட்டல் PCR, cdPCR:

சிலிக்கான் செதில்கள் அல்லது குவார்ட்ஸ் கண்ணாடியில் பல நுண்குழாய்கள் மற்றும் நுண்குழிகளை பொறிக்க ஒருங்கிணைந்த திரவ பாதை தொழில்நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தவும், மேலும் பல்வேறு கட்டுப்பாட்டு வால்வுகள் மூலம் கரைசலின் ஓட்டத்தை கட்டுப்படுத்தவும், மேலும் டிஜிட்டல் பிசிஆர் எதிர்வினைக்கான மாதிரி திரவத்தை அதே அளவிலான நானோமீட்டர்களாக வினைத்திறன் கிணறுகளாக பிரித்து முழுமையான அளவை அடையவும்.

மூன்றாம் தலைமுறை PCR இன் முக்கிய தீமைகள்:

உபகரணங்கள் மற்றும் உலைகள் விலை உயர்ந்தவை.

டெம்ப்ளேட் தரத் தேவைகள் அதிகம்.டெம்ப்ளேட் அளவு மைக்ரோசிஸ்டம் அளவை விட அதிகமாக இருந்தால், அதை அளவிட இயலாது, அது மிகவும் சிறியதாக இருந்தால், அளவீட்டு துல்லியம் குறைக்கப்படும்.

குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கம் இருக்கும்போது தவறான நேர்மறைகளும் உருவாக்கப்படலாம்.