பிசிஆர், பல பிசிஆர், சிட்டு பி.சி.ஆர், தலைகீழ் பிசிஆர், RT-PCR, qPCR (1)–பிசிஆர்

பல்வேறு PCR இன் கருத்துகள், படிகள் மற்றும் விவரங்களை நாங்கள் வரிசைப்படுத்துவோம்

Ⅰ. பிசிஆர்

பிசிஆர் என குறிப்பிடப்படும் பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினை, குறிப்பிட்ட டிஎன்ஏ துண்டுகளை பெரிதாக்கப் பயன்படும் ஒரு மூலக்கூறு உயிரியல் தொழில்நுட்பமாகும்.விட்ரோவில் ஒரு சிறப்பு டிஎன்ஏ பிரதியாக இது கருதப்படலாம்.டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் (டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் I) 1955 ஆம் ஆண்டிலேயே கண்டுபிடிக்கப்பட்டது, மேலும் 1970 களின் முற்பகுதியில் டாக்டர். எச். க்ளெனோவால் சோதனை மதிப்பு மற்றும் நடைமுறைத் திறன் கொண்ட E. கோலியின் க்ளெனோ துண்டு கண்டுபிடிக்கப்பட்டது, ஆனால் இந்த நொதி வெப்பநிலையை பொறுத்துக்கொள்ளாததால், அதிக வெப்பநிலை அதை சிதைக்கக்கூடும், எனவே இது பாலிமரேஸ் வினையை அதிக வெப்பநிலையுடன் சந்திக்காது.இன்று பயன்பாட்டில் உள்ள என்சைம்கள் (டாக் பாலிமரேஸ் என அழைக்கப்படுகின்றன), 1976 ஆம் ஆண்டில் வெப்ப நீரூற்று பாக்டீரியாவான தெர்மஸ் அக்வாடிகஸிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டது. இதன் சிறப்பியல்பு அதிக வெப்பநிலையை எதிர்க்கும் மற்றும் சிறந்த நொதியாகும், ஆனால் இது 1980 களுக்குப் பிறகு பரவலாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது.PCR இன் அசல் பழமையான முன்மாதிரியின் அசல் கருத்து மரபணு சரிசெய்தல் மற்றும் நகலெடுப்பதைப் போன்றது, இது 1971 இல் டாக்டர் கேஜெல் கிளெப்பால் முன்மொழியப்பட்டது. அவர் முதல் எளிய மற்றும் குறுகிய கால மரபணு நகலை வெளியிட்டார் (PCR இன் முதல் இரண்டு சுழற்சி எதிர்வினைகளைப் போன்றது).இன்று உருவாக்கப்பட்ட PCR ஆனது 1983 இல் டாக்டர் கேரி பி. முல்லிஸால் உருவாக்கப்பட்டது. டாக்டர் முல்லிஸ் அந்த ஆண்டு PE நிறுவனங்களுக்கு சேவை செய்தார், எனவே PCR துறையில் PE சிறப்பு அந்தஸ்தைப் பெற்றுள்ளது.டாக்டர் முல்லிஸ் 1985 ஆம் ஆண்டில் சைகி மற்றும் பிறருடன் இணைந்து முதல் தொடர்புடைய கட்டுரையை அதிகாரப்பூர்வமாக வெளியிட்டார். அதன் பின்னர், PCR இன் பயன்பாடு ஒரு நாளைக்கு ஆயிரக்கணக்கான மைல்கள் ஆகும், மேலும் தொடர்புடைய தாள்களின் தரம் பல ஆராய்ச்சி முறைகளை விரும்பத்தகாததாகக் கூறலாம்.பின்னர், PCR தொழில்நுட்பம் உயிரியல் அறிவியல் ஆராய்ச்சி மற்றும் மருத்துவப் பயன்பாடுகளில் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்பட்டு, மூலக்கூறு உயிரியல் ஆராய்ச்சியின் மிக முக்கியமான தொழில்நுட்பமாக மாறியது.முல்லிஸ் 1993 ஆம் ஆண்டு வேதியியலுக்கான நோபல் பரிசையும் வென்றார்.

பிசிஆர்கொள்கை

பிசிஆர் தொழில்நுட்பத்தின் அடிப்படைக் கொள்கையானது டிஎன்ஏவின் இயற்கையான நகலெடுக்கும் செயல்முறையைப் போன்றது, மேலும் அதன் தனித்தன்மையானது இலக்கு வரிசையின் இரு முனைகளுக்கும் துணையாக இருக்கும் ஒலிகோநியூக்ளியோடைடு ப்ரைமரைப் பொறுத்தது.PCR ஆனது டிஜெனரேஷன்-அனீலிங்-நீட்டிப்பு மூன்று அடிப்படை வினைகளின் படிநிலைகளைக் கொண்டது: ① டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட்டின் சிதைவு: வார்ப்புரு டிஎன்ஏ ஒரு குறிப்பிட்ட காலத்திற்கு சுமார் 93 டிகிரி செல்சியஸ் வரை சூடேற்றப்பட்ட பிறகு, பிசிஆர் பெருக்கத்தால் உருவான இரட்டைச் சங்கிலி டிஎன்ஏக்கான இரட்டை டிஎன்ஏ கரைசல், டிஎன்ஏ ஒற்றை எதிர்வினைக்கு அடுத்ததாக ஒரு வினையை உருவாக்குகிறது.②டெம்ப்ளேட் டிஎன்ஏ மற்றும் ப்ரைமரின் அனீலிங் (கலவை): டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட் வெப்பமடைந்து ஒரு சங்கிலியாக சிதைந்த பிறகு, வெப்பநிலை சுமார் 55 டிகிரி செல்சியஸ் வரை குறைகிறது.ப்ரைமர் மற்றும் டெம்ப்ளேட் டிஎன்ஏ ஒற்றை சங்கிலியின் நிரப்பு வரிசை.③ ப்ரைமரின் நீட்டிப்பு: டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட் - ப்ரைமர் பைண்டிங் என்பது டக்டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் செயல்பாட்டை அடிப்படையாகக் கொண்டது, டிஎன்டிபி எதிர்வினை மூலப்பொருளாக உள்ளது.நகலெடுக்கும் கொள்கையை வைத்து, டெம்ப்ளேட் டிஎன்ஏ சங்கிலியை நிறைவு செய்யும் புதிய அரை-ஒதுக்கப்பட்ட நகல் சங்கிலியை ஒருங்கிணைக்கவும், மேலும் சுழற்சி சிதைவு-அனீலிங்-நீட்டிப்பு மூன்று செயல்முறைகள் அதிக "அரை-ஒதுக்கப்பட்ட நகல் சங்கிலியை" பெறலாம், மேலும் இந்த புதிய சங்கிலி மீண்டும் கிடைக்கும், அடுத்த சுழற்சிக்கான டெம்ப்ளேட்டாக மாறவும்.லூப்பை முடிக்க 2-4 நிமிடம் ஆகும், இலக்கு மரபணுவை 2-3 மணி நேரத்தில் பல மில்லியன் முறை பெருக்க முடியும்.

தரநிலைபிசிஆர்எதிர்வினை அமைப்பு

PCR எதிர்வினையின் ஐந்து கூறுகள்

PCR எதிர்வினையில் முக்கியமாக ஐந்து வகையான பொருட்கள் உள்ளன, அதாவது ப்ரைமர், என்சைம், dNTP, டெம்ப்ளேட் மற்றும் பஃபர் (Mg2+ தேவை).[PCR செயல்முறை]

நிலையான PCR செயல்முறை மூன்று படிகளாக பிரிக்கப்பட்டுள்ளது

1. டிஎன்ஏ சிதைவு (90°C-96°C): வெப்பச் செயல்பாட்டின் கீழ் இரட்டைச் சங்கிலி டிஎன்ஏ வார்ப்புருக்கள், ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகள் உடைந்து, ஒற்றைச் சங்கிலி டிஎன்ஏவை உருவாக்குகின்றன.

2. அனீலிங் (25℃ -65℃): கணினி வெப்பநிலை குறைக்கப்படுகிறது, ப்ரைமர் டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட்டுடன் இணைந்து ஒரு உள்ளூர் இரட்டை சங்கிலியை உருவாக்குகிறது.

3. நீட்டிப்பு (70℃ -75℃): Taq நொதியின் செயல்பாட்டின் கீழ் (சுமார் 72°C, சிறந்த செயல்பாடு), dNTP மூலப்பொருளாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, ப்ரைமர் → 3′ முனையின் 5′ முடிவில் இருந்து நீட்டிக்கப்படுகிறது, தொகுப்பு மற்றும் டெம்ப்ளேட் ஒன்றுக்கொன்று DNA சங்கிலியை நிறைவு செய்கின்றன.

ஒவ்வொரு சுழற்சியும் நீக்கப்பட்டு, இணைக்கப்பட்டு நீட்டிக்கப்பட்டு, DNA உள்ளடக்கத்தை இரட்டிப்பாக்குகிறது.தற்போது, ​​குறுகிய பெருக்கப் பகுதியின் காரணமாக, Taq என்சைம் செயல்பாடு உகந்ததாக இல்லாவிட்டாலும், சில PCRகளை மிகக் குறுகிய காலத்தில் நகலெடுக்க முடியும், எனவே அதை இரண்டு படிகளாக மாற்றலாம், அதாவது, 60 ° C-65 ° C வெப்பநிலையில் ஒரே நேரத்தில் அனீலிங் மற்றும் நீட்டிப்பு செய்யப்படலாம்.தூக்குதல் மற்றும் குளிர்விக்கும் செயல்முறையை குறைக்க மற்றும் பதில் வேகத்தை மேம்படுத்துவதற்காக.

பிசிஆர் எதிர்வினை அம்சங்கள்

● உயர்-குறிப்பு

PCR பதிலின் குறிப்பிட்ட தீர்க்கமான காரணிகள்: ①பிரைமர் மற்றும் டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட்டின் குறிப்பிட்ட கலவை.②அடிப்படை இணைத்தல் கொள்கை.③தக்டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் தொகுப்பு எதிர்வினையின் விசுவாசம்.④ இலக்கு மரபணுவின் தனித்தன்மை மற்றும் பழமைத்தன்மை.

ப்ரைமர்கள் மற்றும் டெம்ப்ளேட்களின் சரியான கலவை முக்கியமானது.ப்ரைமர் மற்றும் டெம்ப்ளேட்டின் பிணைப்பு மற்றும் ப்ரைமர் சங்கிலியின் நீட்டிப்பு ஆகியவை அல்கலைன் அடிப்படை பொருத்தத்தின் கொள்கையை அடிப்படையாகக் கொண்டவை.பாலிமரேஸ் தொகுப்பு எதிர்வினைகளின் விசுவாசம் மற்றும் டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் உயர் வெப்பநிலை எதிர்ப்பு ஆகியவை வார்ப்புருவின் பிணைப்பு (கலவை) மற்றும் எதிர்வினையில் ப்ரைமரை அதிக வெப்பநிலையில் செய்ய முடியும்.கலவையின் தனித்தன்மை பெரிதும் அதிகரித்துள்ளது.கிளிப் அதிக அளவு சரியான தன்மையை பராமரிக்க முடியும்.அதிக பழமைவாத மற்றும் அதிக பழமைவாதத்துடன் இலக்கு மரபணு பகுதியை தேர்ந்தெடுப்பதன் மூலம், அதன் தனித்தன்மை அதிகமாக உள்ளது.

● அதிக உணர்திறன்

PCR தயாரிப்புகளின் உற்பத்தி அளவு குறியீட்டால் அதிகரிக்கப்படுகிறது, இது மைக்ரோகண்ட்ரோலரின் அளவை மைக்ரோகிராம்களின் (μg= -6) அளவிற்கு அதிகரிக்க பிக்கரின் (PG=10-12) தொடக்க டெம்ப்ளேட்டை விரிவாக்கலாம்.ஒரு இலக்கு செல்களை 1 மில்லியன் செல்களில் இருந்து கண்டறிய முடியும்;வைரஸ்களைக் கண்டறிவதில், PCR இன் உணர்திறன் 3 RFU களை அடையலாம் (வெற்று புள்ளிகள் உருவாக்கப்பட்ட அலகுகள்);பாக்டீரியா அறிவியலில் குறைந்தபட்ச கண்டறிதல் விகிதம் 3 பாக்டீரியா ஆகும்.

● எளிய மற்றும் வேகமான

PCR பிரதிபலிப்பு உயர்-வெப்பநிலை Taq DNA பாலிமரேஸைப் பயன்படுத்துகிறது, இது ஒரு நேரத்தில் எதிர்வினைத் தீர்வைச் சேர்க்கிறது, அதாவது டிஎன்ஏ பெருக்க தீர்வு மற்றும் நீர் குளியல் தொட்டியில் சிதைவு-அனீல்-நீட்டிப்பு எதிர்வினை.பொதுவாக, பெருக்க வினை 2 முதல் 4 மணி நேரத்தில் முடிவடையும்.பெரிதாக்கப்பட்ட தயாரிப்புகள் பொதுவாக மின் வாள் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகின்றன, மேலும் அவை ஐசோடோப்புகளைப் பயன்படுத்த வேண்டியதில்லை, கதிரியக்க மாசுபாடு இல்லை, மற்றும் எளிதான விளம்பரம்.

● மாதிரியின் தூய்மை குறைவாக உள்ளது

வைரஸ்கள் அல்லது பாக்டீரியாக்கள் மற்றும் கலாச்சார செல்களை பிரிக்க வேண்டிய அவசியமில்லை.டிஎன்ஏ கச்சா பொருட்கள் மற்றும் ஆர்என்ஏவை பெருக்கிகளாகப் பயன்படுத்தலாம்.இரத்தம், உடல் திரவம், இருமல் கழுவும் திரவம், முடி, செல்கள் மற்றும் வாழும் திசு போன்ற மருத்துவ மாதிரிகளைப் பயன்படுத்தி டிஎன்ஏ பெருக்கத்தைக் கண்டறிதல் நேரடியாகப் பயன்படுத்தப்படலாம்.

பிசிஆர்பொதுவான பிரச்சனைகள்

● தவறான எதிர்மறை, பெருக்கப்பட்ட பட்டைகள் இல்லை

PCR எதிர்வினையின் முக்கிய நிலைகளில் பின்வருவன அடங்கும்: ① டெம்ப்ளேட் நியூக்ளிக் அமிலங்களின் தயாரிப்பு, ② தரம் மற்றும் ப்ரைமர்களின் தனித்தன்மை, ③ என்சைம்களின் தரம் ④ PCR சுழற்சி நிலைமைகள்.காரணத்தைக் கண்டறிவதும் மேலே உள்ள இணைப்புகளைப் பகுப்பாய்வு செய்து ஆய்வு செய்ய வேண்டும்.

டெம்ப்ளேட்கள்: ① வார்ப்புருவில் பல்வேறு புரதங்கள் உள்ளன, ② டெம்ப்ளேட்டில் ஒரு Taq என்சைம் தடுப்பான் உள்ளது, ③ டெம்ப்ளேட்டில் உள்ள புரதம் அகற்றப்படவில்லை, குறிப்பாக குரோமோசோமில் உள்ள குழு புரதம்.⑤ டெமினர் நியூக்ளிக் அமில சிதைவு முழுமையாக இல்லை.என்சைம்கள் மற்றும் ப்ரைமர்களின் தரம் நன்றாக இருக்கும் போது, ​​எந்த ஒரு பெருக்கி இசைக்குழுவும் இல்லை, இது பெரும்பாலும் மாதிரிகளின் செரிமான சிகிச்சையாகும்.டெம்ப்ளேட் நியூக்ளிக் அமிலம் பிரித்தெடுத்தல் செயல்பாட்டில் ஏதோ தவறு உள்ளது, எனவே ஒரு பயனுள்ள மற்றும் நிலையான செரிமான தீர்வு தயாரிக்க, அதன் செயல்முறை சரி செய்யப்பட வேண்டும் மற்றும் தன்னிச்சையாக மாற்றப்படக்கூடாது.

என்சைம் செயலிழக்கச் செய்தல்: ஒரு புதிய நொதி அல்லது பழைய மற்றும் புதிய நொதிகள் இரண்டையும் ஒன்றாகப் பயன்படுத்தி நொதியின் செயல்பாடு தொலைந்துவிட்டதா அல்லது போதுமானதாக இல்லாவிட்டாலும், தவறான எதிர்மறைகளுக்கு வழிவகுக்கும்.டாக் என்சைம் அல்லது எத்திடியம் புரோமைடு சில சமயங்களில் மறந்துவிடும் என்பதை கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும்.

ப்ரைமர்: ப்ரைமரின் தரம், ப்ரைமரின் செறிவு மற்றும் இரண்டு ப்ரைமர்களின் செறிவு சமச்சீராக உள்ளதா.பிசிஆர் தோல்விக்கு இது ஒரு பொதுவான காரணம் அல்லது அதிகரித்து வரும் இசைக்குழு சிறந்ததாக இல்லை மற்றும் பரவக்கூடியது.சில தொகுதி எண்களின் ப்ரைமர்களின் தரத்தில் சிக்கல்கள் உள்ளன.இரண்டு ப்ரைமர்களும் அதிக செறிவு மற்றும் குறைந்த செறிவு கொண்டவை, குறைந்த செயல்திறன் கொண்ட சமச்சீரற்ற பெருக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது.எதிர் நடவடிக்கைகள்: ① அலகுகளை ஒருங்கிணைக்க ஒரு நல்ல ப்ரைமரைத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.② ப்ரைமரின் செறிவு OD மதிப்பைச் சார்ந்தது மட்டுமல்லாமல், அகார் சர்க்கரை ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸை உருவாக்க ப்ரைமரின் அசல் திரவத்திற்கும் கவனம் செலுத்துகிறது.ஒரு ப்ரைமர் ஸ்ட்ரிப் மண்டலம் இருக்க வேண்டும், மேலும் இரண்டு ப்ரைமர்களின் பிரகாசம் பொதுவாக சீரானதாக இருக்க வேண்டும்.பெல்ட், PCR இந்த நேரத்தில் தோல்வியடையக்கூடும், மேலும் இது ப்ரைமர் தொகுப்பு அலகு மூலம் தீர்க்கப்பட வேண்டும்.ஒரு ப்ரைமர் அதிகமாக இருந்தால், பிரகாசம் குறைவாக இருக்கும், மேலும் நீர்த்தும்போது அதன் செறிவு சமநிலையில் இருக்க வேண்டும்.③ ப்ரைமருக்கு பணம் செலுத்தப்பட்டு, குளிர்சாதனப்பெட்டியின் பல உறைபனி அல்லது நீண்ட கால குளிர்பதனப் பகுதிகளைத் தடுக்க அதிக செறிவூட்டலில் சேமிக்கப்பட வேண்டும், இது ப்ரைமரை மோசமடையச் செய்து சிதைக்கும்.④ ப்ரைமரின் வடிவமைப்பு நியாயமற்றது, அதாவது ப்ரைமரின் நீளம் போதுமானதாக இல்லை, மற்றும் ப்ரைமர்களுக்கு இடையில் டி கிளஸ்டர் உருவாகிறது.

Mg2+ செறிவு: Mg2+ அயன் செறிவு PCR பெருக்க செயல்திறனில் பெரும் தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது.அதிகப்படியான செறிவு PCR பெருக்கத்தின் எதிர் பாலினத்தை குறைக்கலாம்.செறிவு மிகக் குறைவாக இருந்தால், PCR பெருக்க வெளியீடு விரிவாக்கப் பட்டை இல்லாமலேயே PCR பெருக்கத்தை தோல்வியடையச் செய்யும்.

எதிர்வினை அளவின் மாற்றம்: PCR பெருக்கத்தில் பயன்படுத்தப்படும் அளவு 20ul, 30ul, மற்றும் 50ul அல்லது 100uL ஆகும், PCR பெருக்கத்திற்கான பயன்பாட்டின் பெரிய அளவு அறிவியல் ஆராய்ச்சி மற்றும் மருத்துவ பரிசோதனையின் வெவ்வேறு நோக்கங்களின்படி அமைக்கப்பட்டுள்ளது.20ul போன்ற சிறிய தொகுதிகளை உருவாக்கிய பிறகு, அளவை உருவாக்கும் போது ஒரு தண்டு நிலையை உருவாக்குவது அவசியம், இல்லையெனில் அது தோல்வியடையும்.

உடல் காரணங்கள்: PCR பெருக்கத்திற்கு மாற்றம் மிகவும் முக்கியமானது.சிதைவு வெப்பநிலை குறைவாக இருந்தால், சிதைவு நேரம் குறுகியதாக இருந்தால், அது தவறான எதிர்மறைகளில் ஏற்பட வாய்ப்புள்ளது;மிகக் குறைந்த அனீலிங் வெப்பநிலையானது குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்தை ஏற்படுத்தலாம் மற்றும் குறிப்பிட்ட பெருக்க செயல்திறனைக் குறைக்கலாம்.PCR பெருக்க செயல்திறனைக் குறைக்க ப்ரைமர்கள் மற்றும் டெம்ப்ளேட்களின் கலவையை மிகவும் பாதிக்கிறது.சில சமயங்களில் பிசிஆர் தோல்விக்கான காரணங்களில் ஒன்றான நீட்டிப்பு அல்லது நீரில் கரையக்கூடிய குக்கரில் உள்ள மாறுபாடு, அனீலிங் மற்றும் நீட்டிக்கப்பட்ட வெப்பநிலையைக் கண்டறிய நிலையான வெப்பமானிகளைப் பயன்படுத்துவது அவசியம்.

இலக்கு வரிசை மாறுபாடுகள்: இலக்கு வரிசை ஏற்பட்டால், ஒரு பிறழ்வு அல்லது நீக்குதல், முன்மாதிரி மற்றும் டெம்ப்ளேட்டின் கலவையானது அல்லது இலக்கு வரிசை இல்லாததால், ப்ரைமர் மற்றும் டெம்ப்ளேட் நிரப்பு வரிசையை இழக்கும், மேலும் அதன் PCR பெருக்கம் வெற்றிகரமாக இருக்காது.

● தவறான நேர்மறை

PCR பெருக்க இசைக்குழு இலக்கு வரிசை இசைக்குழுவுடன் ஒத்துப்போகிறது, மேலும் சில நேரங்களில் அதன் இசைக்குழு மிகவும் நேர்த்தியாகவும் அதிகமாகவும் இருக்கும்.

முதன்மை வடிவமைப்பு பொருத்தமானது அல்ல: தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பெருக்க வரிசை மற்றும் நோக்கமற்ற பெருக்க வரிசை ஆகியவை ஒரே மாதிரியானவை, எனவே PCR பெருக்கத்தின் போது, ​​பெருக்கப்பட்ட PCR தயாரிப்புகள் நோக்கமற்ற வரிசைகளாக இருக்கும்.இலக்கு வரிசை மிகவும் குறுகியதாக உள்ளது அல்லது ப்ரைமர் மிகவும் குறுகியதாக உள்ளது, மேலும் இது தவறான நேர்மறைக்கு ஆளாகிறது.மறுவடிவமைப்பு செய்ய வேண்டும்.

இலக்கு வரிசை அல்லது பெருக்க தயாரிப்புகளின் குறுக்கு மாசுபாடு: இந்த மாசுபாட்டிற்கு இரண்டு காரணங்கள் உள்ளன: முதலில், முழு மரபணு அல்லது பெரிய பிரிவுகளின் குறுக்கு மாசுபாடு, தவறான நேர்மறைகளுக்கு வழிவகுக்கிறது.இந்த வகையான தவறான நேர்மறையை பின்வரும் முறைகள் மூலம் தீர்க்கலாம்: செயல்பாட்டின் போது கவனமாகவும் மென்மையாகவும் இருக்கவும், இலக்கு வரிசையை மாதிரி துப்பாக்கியில் உள்ளிழுப்பதைத் தடுக்கவும் அல்லது மையவிலக்குக் குழாயிலிருந்து வெளியே தெறிக்கவும்.அதிக வெப்பநிலையைத் தாங்க முடியாத என்சைம்கள் மற்றும் பொருட்களைத் தவிர, அனைத்து வினைகளும் அல்லது உபகரணங்களும் அதிக அழுத்தத்துடன் கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட வேண்டும்.மையவிலக்கு குழாய்கள் மற்றும் மாதிரிகள் ஒரே நேரத்தில் பயன்படுத்தப்பட வேண்டும்.தேவைப்படும்போது, ​​மாதிரிகளைச் சேர்ப்பதற்கு முன், எதிர்வினைக் குழாய் மற்றும் வினைப்பொருளானது ஏற்கனவே இருக்கும் நியூக்ளிக் அமிலத்தை அழிக்க புற ஊதாக் கதிர்களுக்கு வெளிப்படும்.இரண்டாவது, காற்று மாசுபாட்டில் சிறிய துண்டுகள்.இந்த சிறிய துண்டுகள் இலக்கு வரிசையை விட சிறியவை, ஆனால் அவை சில ஹோமோலஜியைக் கொண்டுள்ளன.இது ஒன்றோடொன்று பிரிக்கப்படலாம்.ப்ரைமர்களை நிறைவு செய்த பிறகு, PCR தயாரிப்பை விரிவாக்கலாம், இது தவறான நேர்மறை உற்பத்தியை ஏற்படுத்தும்.இது கூடு PCR முறையை குறைக்க அல்லது அகற்ற பயன்படுகிறது.

● குறிப்பிடப்படாத பெருக்க இசைக்குழு தோன்றும்

PCR பெருக்கத்திற்குப் பிறகு தோன்றிய பட்டைகள் எதிர்பார்த்த அளவு, அல்லது பெரிய அல்லது சிறிய, அல்லது அதே நேரத்தில், அல்லது அதே நேரத்தில், குறிப்பிட்ட பெருக்க பட்டைகள் மற்றும் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்க பட்டைகள் ஆகியவற்றுடன் ஒத்துப்போகவில்லை.குறிப்பிடப்படாத பட்டைகளின் தோற்றம்: முதலாவதாக, ப்ரைமர்கள் இலக்கு வரிசைக்கு முழுமையடையாத நிரப்பு அல்லது டை கிளஸ்டரை உருவாக்க ப்ரைமரின் பாலிமரைசேஷன்.இரண்டாவது MG2+அயனிகளின் செறிவு மிக அதிகமாக உள்ளது, அனீலிங் வெப்பநிலை மிகவும் குறைவாக உள்ளது மற்றும் PCR சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை தொடர்புடையது.இரண்டாவதாக, என்சைம்களின் தரம் மற்றும் அளவு.பெரும்பாலும், சில மூலங்களின் நொதிகள் சிறப்பு அல்லாத பட்டைகளுக்கு வாய்ப்புள்ளது மற்றும் பிற மூலத்தின் நொதிகள் ஏற்படாது.சில நேரங்களில் என்சைம்களின் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கமும் ஏற்படுகிறது.எதிர் நடவடிக்கைகள்: தேவைப்பட்டால் மீண்டும் வடிவமைக்கப்பட்ட கவர்ச்சிகரமானவை.நொதியின் அளவைக் குறைக்கவும் அல்லது மற்றொரு மூலத்தின் நொதியை மாற்றவும்.முதன்மை அளவைக் குறைக்கவும், வார்ப்புருக்களின் அளவை சரியான முறையில் அதிகரிக்கவும் மற்றும் சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையைக் குறைக்கவும்.அனீலிங் வெப்பநிலையை சரியாக அதிகரிக்கவும் அல்லது இரண்டு வெப்பநிலை புள்ளி முறையைப் பயன்படுத்தவும் (93 டிகிரி செல்சியஸ் சிதைவு, அனீலிங் மற்றும் சுமார் 65 டிகிரி செல்சியஸ் வரை நீட்டித்தல்).

● ஃபிளாக்கி டோ அல்லது ஸ்மியர் டேப் தோன்றும்

PCR பெருக்கம் சில நேரங்களில் பயன்படுத்தப்படும் அல்லது ஷெல் அல்லது தரைவிரிப்பு போன்ற பெல்ட் போல் தோன்றுகிறது.காரணம், அதிகப்படியான நொதிகள் அல்லது நொதியின் மோசமான தரம் காரணமாக, dNTP செறிவு மிக அதிகமாக உள்ளது, Mg2+ செறிவு அதிகமாக உள்ளது, அனீலிங் வெப்பநிலை மிகவும் குறைவாக உள்ளது மற்றும் சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை அதிகமாக உள்ளது.எதிர் நடவடிக்கைகள்: ①என்சைம்களின் அளவைக் குறைத்தல் அல்லது மற்றொரு மூலத்தின் நொதியை மாற்றுதல்.②dNTPயின் செறிவைக் குறைக்கவும் ③Mg2+ செறிவைச் சரியாகக் குறைக்கவும்.④ டெம்ப்ளேட்களின் அளவை அதிகரிக்கவும் மற்றும் சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையை குறைக்கவும்.

தொடர்புடைய தயாரிப்புகள்

PCR Heroᴹ (சாயத்துடன்)

◮ அதிக நம்பகத்தன்மை: சாதாரண Taq நொதியை விட 6 மடங்கு;

◮ வேகமான பெருக்க வேகம்

◮ மேலும் டெம்ப்ளேட் ஏற்புத்திறன்

◮ அதிக பெருக்க திறன்

◮ சுற்றுச்சூழல் சகிப்புத்தன்மை வலுவானது: ஒரு வாரத்திற்கு 37 ° C இல் வைக்கப்பட்டு, 90% க்கும் அதிகமான செயல்பாட்டை பராமரிக்கிறது;

◮ இது 5'→3' டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் செயல்பாடு மற்றும் 5'→3' எக்ஸோநியூக்லீஸ் செயல்பாடு, 3'→5' எக்ஸோநியூக்லீஸ் செயல்பாடு இல்லாமல் உள்ளது.

PCR ஈஸி (சாயத்துடன்)

தனித்துவமான எதிர்வினை அமைப்பு மற்றும் உயர்-செயல்திறன் Taq DNA பாலிமரேஸ் ஆகியவை PCR எதிர்வினை அதிக பெருக்க திறன், தனித்தன்மை மற்றும் உணர்திறன் ஆகியவற்றைக் கொண்டிருக்கின்றன.

RT-qPCR Easyᴹ (ஒரு படி)-SYBR பசுமை I

◮ ஒரு-படி கிட் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் qPCR ஐ ஒரே குழாயில் இரண்டு எதிர்வினைகளை உருவாக்குகிறது, டெம்ப்ளேட் RNA, குறிப்பிட்ட PCR ப்ரைமர்கள் மற்றும் RNase-Free ddH ஆகியவற்றை மட்டும் சேர்க்க வேண்டும்₂O.

◮ கிட் விரைவாகவும் திறமையாகவும் வைரல் ஆர்என்ஏவை பகுப்பாய்வு செய்யலாம் அல்லது ஆர்என்ஏவைக் கண்டறியலாம்.

◮ கிட் ஒரு தனித்துவமான Foregene ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ரீஜென்ட் மற்றும் Foregene HotStar Taq DNA பாலிமரேஸ் ஒரு தனித்துவமான எதிர்வினை அமைப்புடன் இணைந்து வினையின் பெருக்க திறன் மற்றும் தனித்துவத்தை திறம்பட மேம்படுத்துகிறது.

◮ உகந்த எதிர்வினை அமைப்பு எதிர்வினையை அதிக கண்டறிதல் உணர்திறன், வலுவான வெப்ப நிலைத்தன்மை மற்றும் சிறந்த சகிப்புத்தன்மை ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது.

◮ RT-qPCR எளிதானது^TM(ஒரு படி)-SYBR Green I கிட் ROX இன்டர்னல் ரெஃபரன்ஸ் டையுடன் வருகிறது, இது சிக்னல் பின்னணி மற்றும் கிணறுகளுக்கு இடையே உள்ள சிக்னல் பிழைகளை அகற்ற பயன்படுகிறது, இது வாடிக்கையாளர்கள் வெவ்வேறு மாதிரியான அளவு PCR கருவிகளில் பயன்படுத்த வசதியாக உள்ளது.

RT ஈஸி^TMII (மாஸ்டர் பிரீமிக்ஸ் முதல் இழை சிடிஎன்ஏ தொகுப்புரியல் டைம் பிசிஆர்)

-ஜிடிஎன்ஏவை அகற்றுவதற்கான திறமையான திறன், இது வார்ப்புருவில் உள்ள ஜிடிஎன்ஏவை 2 நிமிடங்களுக்குள் அகற்றும்.

திறமையான ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் சிஸ்டம், முதல் ஸ்ட்ராண்ட் சிடிஎன்ஏவின் தொகுப்பை முடிக்க 15 நிமிடங்கள் மட்டுமே ஆகும்.

-சிக்கலான வார்ப்புருக்கள்: உயர் GC உள்ளடக்கம் மற்றும் சிக்கலான இரண்டாம் நிலை அமைப்புடன் கூடிய வார்ப்புருக்கள் உயர் செயல்திறனுடன் மாற்றியமைக்கப்படலாம்.

-உயர் உணர்திறன் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் அமைப்பு, pg-நிலை டெம்ப்ளேட்கள் உயர்தர சிடிஎன்ஏவைப் பெறலாம்.

-தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் அமைப்பு அதிக வெப்ப நிலைத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளது, உகந்த எதிர்வினை வெப்பநிலை 42℃, மேலும் இது 50℃ இல் நல்ல தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்திறனைக் கொண்டுள்ளது.