• பிசிஆர் என்பது டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட்டின் சிறிய அளவிலான டிஎன்ஏவைப் பெருக்கப் பயன்படும் ஒரு முறையாகும்.ஆர்என்ஏ மூலத்திலிருந்து டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட்டை உருவாக்க, ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனை ஆர்டி-பிசிஆர் பயன்படுத்துகிறது.
• PCR மற்றும் RT-PCR ஆகியவை பொதுவாக இறுதிப்புள்ளி எதிர்வினைகளாகும், அதே சமயம் qPCR மற்றும் RT-qPCR ஆகியவை PCR எதிர்வினையின் போது தயாரிப்பு தொகுப்பு விகிதத்தின் இயக்கவியலைப் பயன்படுத்தி தற்போதுள்ள டெம்ப்ளேட்டின் அளவைக் கணக்கிடுகின்றன.
• டிஜிட்டல் PCR போன்ற புதிய முறைகள், ஆரம்ப DNA டெம்ப்ளேட்டின் முழுமையான அளவை வழங்குகின்றன, அதே சமயம் சமவெப்ப PCR போன்ற முறைகள் நம்பகமான முடிவுகளை வழங்க விலையுயர்ந்த உபகரணங்களின் தேவையைக் குறைக்கின்றன.

பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினை (PCR) என்பது டிஎன்ஏ மற்றும் ஆர்என்ஏ வரிசைகளை பெருக்க மற்றும் கண்டறிய ஒப்பீட்டளவில் எளிமையான மற்றும் பரவலாக பயன்படுத்தப்படும் மூலக்கூறு உயிரியல் நுட்பமாகும்.டிஎன்ஏ குளோனிங் மற்றும் பெருக்கத்தின் பாரம்பரிய முறைகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​இது பெரும்பாலும் நாட்கள் ஆகலாம், PCR க்கு சில மணிநேரங்கள் மட்டுமே தேவைப்படுகிறது.PCR மிகவும் உணர்திறன் கொண்டது மற்றும் குறிப்பிட்ட தொடர்களைக் கண்டறிந்து பெருக்குவதற்கு குறைந்தபட்ச டெம்ப்ளேட் தேவைப்படுகிறது.அடிப்படை PCR முறைகள் எளிமையான DNA மற்றும் RNA கண்டறிதலில் இருந்து மேலும் முன்னேறியுள்ளன.கீழே, உங்கள் ஆராய்ச்சித் தேவைகளுக்காக என்ஸோ லைஃப் சயின்ஸில் நாங்கள் வழங்கும் வெவ்வேறு PCR முறைகள் மற்றும் எதிர்வினைகளின் மேலோட்டத்தை வழங்கியுள்ளோம்.விஞ்ஞானிகள் தங்கள் அடுத்த ஆராய்ச்சி திட்டத்தில் பயன்படுத்த PCR வினைகளை விரைவாக அணுக உதவுவதை நோக்கமாகக் கொண்டுள்ளோம்!

பிசிஆர்

நிலையான PCRக்கு, டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ், மெக்னீசியம், நியூக்ளியோடைடுகள், ப்ரைமர்கள், பெருக்கப்பட வேண்டிய டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட் மற்றும் ஒரு தெர்மோசைக்ளர் மட்டுமே தேவை.PCR பொறிமுறையானது அதன் நோக்கத்தைப் போலவே எளிமையானது: 1) இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏ (டிஎஸ்டிஎன்ஏ) வெப்பம் குறைக்கப்பட்டது, 2) ப்ரைமர்கள் ஒற்றை டிஎன்ஏ இழைகளுடன் சீரமைக்கப்படுகின்றன, மேலும் 3) டிஎன்ஏ பாலிமரேஸால் ப்ரைமர்கள் நீட்டிக்கப்படுகின்றன, இதன் விளைவாக இரண்டு பிரதிகள் உருவாகின்றன. அசல் டிஎன்ஏ இழை.தொடர்ச்சியான வெப்பநிலைகள் மற்றும் நேரங்களின் மீது டீனாட்டரேஷன், அனீலிங் மற்றும் நீட்டிப்பு செயல்முறை பெருக்கத்தின் ஒரு சுழற்சி என்று அழைக்கப்படுகிறது (படம் 1).

சுழற்சியின் ஒவ்வொரு படியும் பயன்படுத்தப்படும் டெம்ப்ளேட் மற்றும் ப்ரைமர் தொகுப்பிற்கு உகந்ததாக இருக்க வேண்டும்.இந்த சுழற்சி தோராயமாக 20-40 முறை மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்படுகிறது, மேலும் பெருக்கப்பட்ட தயாரிப்பு பின்னர் பொதுவாக அகரோஸ் ஜெல் (படம் 2) மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்படலாம்.

PCR மிகவும் உணர்திறன் வாய்ந்த முறையாகவும், ஒற்றை எதிர்வினைகளுக்கு மிகச் சிறிய அளவுகள் தேவைப்படுவதால், பல எதிர்வினைகளுக்கு ஒரு முதன்மை கலவையை தயாரிப்பது பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.மாஸ்டர் கலவை நன்கு கலக்கப்பட்டு, வினைகளின் எண்ணிக்கையால் பிரிக்கப்பட வேண்டும், ஒவ்வொரு வினையிலும் அதே அளவு நொதிகள், dNTPகள் மற்றும் ப்ரைமர்கள் இருப்பதை உறுதிசெய்ய வேண்டும்.என்ஸோ லைஃப் சயின்சஸ் போன்ற பல சப்ளையர்களும் பிசிஆர் கலவைகளை வழங்குகிறார்கள், அவை ஏற்கனவே ப்ரைமர்கள் மற்றும் டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட்டைத் தவிர அனைத்தையும் கொண்டிருக்கின்றன.

குவானைன்/சைட்டோசின் நிறைந்த (ஜிசி-ரிச்) பகுதிகள் நிலையான பிசிஆர் நுட்பங்களில் சவாலாக உள்ளன.குறைந்த GC உள்ளடக்கம் கொண்ட தொடர்களை விட GC நிறைந்த வரிசைகள் மிகவும் நிலையானவை.மேலும், GC நிறைந்த தொடர்கள், ஹேர்பின் லூப்கள் போன்ற இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்புகளை உருவாக்க முனைகின்றன.இதன் விளைவாக, டீனாட்டரேஷன் கட்டத்தில் GC நிறைந்த இரட்டை இழைகளை முற்றிலும் பிரிப்பது கடினம்.இதன் விளைவாக, டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் புதிய இழையை தடையின்றி ஒருங்கிணைக்க முடியாது.அதிக டினாட்டரேஷன் வெப்பநிலை இதை மேம்படுத்தலாம், மேலும் அதிக அனீலிங் வெப்பநிலை மற்றும் குறுகிய அனீலிங் நேரத்தை நோக்கிய சரிசெய்தல் GC நிறைந்த ப்ரைமர்களின் குறிப்பிடப்படாத பிணைப்பைத் தடுக்கலாம்.கூடுதல் வினைகள் GC நிறைந்த வரிசைகளின் பெருக்கத்தை மேம்படுத்தலாம்.டிஎம்எஸ்ஓ, கிளிசரால் மற்றும் பீடைன் ஆகியவை ஜிசி இடைவினைகளால் ஏற்படும் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்புகளை சீர்குலைக்க உதவுகின்றன, இதன் மூலம் இரட்டை இழைகளை பிரிக்க உதவுகிறது.

ஹாட் ஸ்டார்ட் பிசிஆர்

குறிப்பிடப்படாத பெருக்கம் என்பது PCR இன் போது ஏற்படக்கூடிய ஒரு பிரச்சனையாகும்.PCR க்காகப் பயன்படுத்தப்படும் பெரும்பாலான DNA பாலிமரேஸ்கள் 68°C முதல் 72°C வரையிலான வெப்பநிலையில் சிறப்பாகச் செயல்படுகின்றன.இருப்பினும், நொதி குறைந்த வெப்பநிலையிலும் செயலில் இருக்கும், இருப்பினும் குறைந்த அளவில்.அனீலிங் வெப்பநிலைக்கு மிகக் குறைவான வெப்பநிலையில், ப்ரைமர்கள் குறிப்பிட்டதாக அல்லாத பிணைப்பு மற்றும் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்திற்கு வழிவகுக்கும், எதிர்வினை பனியில் அமைக்கப்பட்டிருந்தாலும் கூட.ஒரு குறிப்பிட்ட வெப்பநிலையை அடைந்தவுடன் மட்டுமே DNA பாலிமரேஸிலிருந்து பிரியும் பாலிமரேஸ் தடுப்பான்களைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் இதைத் தடுக்கலாம், எனவே ஹாட் ஸ்டார்ட் பிசிஆர் என்ற சொல்.தடுப்பானானது பாலிமரேஸை பிணைக்கும் ஆன்டிபாடியாக இருக்கலாம் மற்றும் ஆரம்ப டினாட்டரேஷன் வெப்பநிலையில் (பொதுவாக 95 டிகிரி செல்சியஸ்).

உயர் நம்பக பாலிமரேஸ்

டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ்கள் அசல் டெம்ப்ளேட் வரிசைக்கு மிகவும் துல்லியமாக பெருக்கும் போது, ​​நியூக்ளியோடைடு பொருத்தத்தில் தவறுகள் ஏற்படலாம்.குளோனிங் போன்ற பயன்பாடுகளில் பொருந்தாததால் துண்டிக்கப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் தவறாக மொழிபெயர்க்கப்பட்ட அல்லது செயலற்ற புரதங்கள் கீழ்நிலையில் ஏற்படலாம்.இந்த பொருந்தாத தன்மைகளைத் தவிர்க்க, "சரிபார்த்தல்" செயல்பாட்டைக் கொண்ட பாலிமரேஸ்கள் அடையாளம் காணப்பட்டு, பணிப்பாய்வுகளில் இணைக்கப்பட்டுள்ளன.முதல் சரிபார்ப்பு பாலிமரேஸ், Pfu, 1991 இல் Pyrococcus furiosus இல் அடையாளம் காணப்பட்டது.இந்த Pfu என்சைம் 3' to 5' exonuclease செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளது.டிஎன்ஏ பெருக்கப்படுவதால், இழையின் 3' முடிவில் பொருந்தாத நியூக்ளியோடைடுகளை எக்ஸோநியூக்லீஸ் நீக்குகிறது.சரியான நியூக்ளியோடைடு பின்னர் மாற்றப்பட்டு, டிஎன்ஏ தொகுப்பு தொடர்கிறது.தவறான நியூக்ளியோடைடு வரிசைகளை அடையாளம் காண்பது, என்சைமுடன் சரியான நியூக்ளியோசைட் ட்ரைபாஸ்பேட்டிற்கான பிணைப்புத் தொடர்பை அடிப்படையாகக் கொண்டது, இதில் திறமையற்ற பிணைப்பு தொகுப்பைக் குறைக்கிறது மற்றும் சரியான மாற்றத்தை அனுமதிக்கிறது.டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸுடன் ஒப்பிடும்போது பிஃபு பாலிமரேஸின் சரிபார்ப்பு செயல்பாடு இறுதி வரிசையில் குறைவான பிழைகளை ஏற்படுத்துகிறது.சமீபத்திய ஆண்டுகளில், பிற சரிபார்ப்பு என்சைம்கள் அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளன, மேலும் டிஎன்ஏ பெருக்கத்தின் போது பிழை விகிதத்தை மேலும் குறைக்க அசல் Pfu நொதியின் மாற்றங்கள் செய்யப்பட்டுள்ளன.

RT-PCR

ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் பிசிஆர், அல்லது ஆர்டி-பிசிஆர், ஆர்என்ஏவை டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்த அனுமதிக்கிறது.கூடுதல் படி ஆர்என்ஏவைக் கண்டறிந்து பெருக்க அனுமதிக்கிறது.ஆர்என்ஏ, ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸைப் பயன்படுத்தி நிரப்பு டிஎன்ஏ (சிடிஎன்ஏ) க்கு தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் செய்யப்படுகிறது.RT-PCR இன் வெற்றிக்கு RNA டெம்ப்ளேட்டின் தரம் மற்றும் தூய்மை அவசியம்.RT-PCR இன் முதல் படி DNA/RNA கலப்பினத்தின் தொகுப்பு ஆகும்.தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் ஒரு RNase H செயல்பாட்டையும் கொண்டுள்ளது, இது கலப்பினத்தின் RNA பகுதியை சிதைக்கிறது.ஒற்றை இழையுடைய டிஎன்ஏ மூலக்கூறு பின்னர் டிஎன்ஏ-சார்ந்த டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் செயல்பாட்டின் மூலம் சிடிஎன்ஏவாக மாற்றப்படுகிறது.முதல் இழை எதிர்வினையின் செயல்திறன் பெருக்க செயல்முறையை பாதிக்கலாம்.இங்கிருந்து, சிடிஎன்ஏவைப் பெருக்க நிலையான பிசிஆர் செயல்முறை பயன்படுத்தப்படுகிறது.ஆர்டி-பிசிஆர் மூலம் ஆர்என்ஏவை சிடிஎன்ஏவாக மாற்றும் சாத்தியம் பல நன்மைகளைக் கொண்டுள்ளது, மேலும் இது முதன்மையாக மரபணு வெளிப்பாடு பகுப்பாய்விற்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.ஆர்என்ஏ ஒற்றை இழை மற்றும் மிகவும் நிலையற்றது, இது வேலை செய்வதை சவாலாக ஆக்குகிறது.இது பொதுவாக qPCR இன் முதல் படியாக செயல்படுகிறது, இது உயிரியல் மாதிரியில் RNA டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளை அளவிடுகிறது.

qPCR மற்றும் RT-qPCR

அளவு PCR (qPCR) பல பயன்பாடுகளுக்கு நியூக்ளிக் அமிலங்களைக் கண்டறியவும், வகைப்படுத்தவும் மற்றும் அளவிடவும் பயன்படுகிறது.RT-qPCR இல், RNA டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மேலே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, முதலில் அவற்றை சிடிஎன்ஏவில் மாற்றியமைப்பதன் மூலம் அளவிடப்படுகின்றன, பின்னர் qPCR பின்னர் மேற்கொள்ளப்படுகிறது.நிலையான PCRஐப் போலவே, டிஎன்ஏ மூன்று தொடர்ச்சியான படிகளால் பெருக்கப்படுகிறது: டினாட்டரேஷன், அனீலிங் மற்றும் நீட்டல்.இருப்பினும், qPCR இல், ஃப்ளோரசன்ட் லேபிளிங் PCR முன்னேறும்போது தரவு சேகரிப்பை செயல்படுத்துகிறது.கிடைக்கக்கூடிய முறைகள் மற்றும் இரசாயனங்களின் வரம்பு காரணமாக இந்த நுட்பம் பல நன்மைகளைக் கொண்டுள்ளது.

சாய அடிப்படையிலான qPCR இல் (பொதுவாக பச்சை), ஃப்ளோரசன்ட் லேபிளிங் ஒரு டிஎஸ்டிஎன்ஏ பிணைப்பு சாயத்தைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் பெருக்கப்பட்ட டிஎன்ஏ மூலக்கூறுகளை அளவிட அனுமதிக்கிறது.ஒவ்வொரு சுழற்சியின் போதும், ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவிடப்படுகிறது.ஃப்ளோரசன்ஸ் சிக்னல் பிரதி டிஎன்ஏ அளவுக்கு விகிதாசாரமாக அதிகரிக்கிறது.எனவே, டிஎன்ஏ "நிகழ்நேரத்தில்" (படம் 3) அளவிடப்படுகிறது.சாய அடிப்படையிலான qPCR இன் குறைபாடுகள் என்னவென்றால், ஒரு நேரத்தில் ஒரே ஒரு இலக்கை மட்டுமே ஆய்வு செய்ய முடியும் மற்றும் சாயம் மாதிரியில் உள்ள எந்த ds-DNA உடன் இணைக்கப்படும்.

ஆய்வு அடிப்படையிலான qPCR இல், ஒவ்வொரு மாதிரியிலும் ஒரே நேரத்தில் பல இலக்குகளைக் கண்டறிய முடியும், ஆனால் இதற்கு ப்ரைமர்களுடன் கூடுதலாகப் பயன்படுத்தப்படும் இலக்கு-குறிப்பிட்ட ஆய்வு(களின்) தேர்வுமுறை மற்றும் வடிவமைப்பு தேவைப்படுகிறது.பல வகையான ஆய்வு வடிவமைப்புகள் கிடைக்கின்றன, ஆனால் மிகவும் பொதுவான வகை நீர்ப்பகுப்பு ஆய்வு ஆகும், இது ஒரு ஃப்ளோரோஃபோர் மற்றும் க்வென்சர் ஆகியவற்றை உள்ளடக்கியது.ஃப்ளோரசன்ஸ் ரெசோனன்ஸ் எனர்ஜி டிரான்ஸ்ஃபர் (FRET) ஆனது, ஆய்வு அப்படியே இருக்கும் போது, ​​க்வென்சர் வழியாக ஃப்ளோரோஃபோரின் உமிழ்வைத் தடுக்கிறது.இருப்பினும், PCR எதிர்வினையின் போது, ​​ப்ரைமர் நீட்டிப்பு மற்றும் அது பிணைக்கப்பட்ட குறிப்பிட்ட வரிசையின் பெருக்கத்தின் போது ஆய்வு ஹைட்ரோலைஸ் செய்யப்படுகிறது.ஆய்வின் பிளவு, ஃப்ளோரோஃபோரை அணைப்பதில் இருந்து பிரிக்கிறது மற்றும் ஃப்ளோரசன்ஸில் பெருக்கம் சார்ந்த அதிகரிப்பை ஏற்படுத்துகிறது (படம் 4).எனவே, ஆய்வு அடிப்படையிலான qPCR எதிர்வினையின் ஒளிரும் சமிக்ஞை மாதிரியில் இருக்கும் ஆய்வு இலக்கு வரிசையின் அளவிற்கு விகிதாசாரமாகும்.சாய அடிப்படையிலான qPCR ஐ விட ஆய்வு அடிப்படையிலான qPCR மிகவும் குறிப்பிட்டதாக இருப்பதால், இது பெரும்பாலும் qPCR- அடிப்படையிலான கண்டறியும் மதிப்பீடுகளில் பயன்படுத்தப்படும் தொழில்நுட்பமாகும்.

சமவெப்ப பெருக்கம்

மேலே குறிப்பிட்டுள்ள PCR க்கு அறை வெப்பநிலையைத் துல்லியமாக உயர்த்துவதற்கும், குறைப்பதற்கும், அனீலிங் செய்வதற்கும், நீட்டிக்கும் படிகளுக்கும் விலை உயர்ந்த தெர்மோசைக்ளிங் கருவிகள் தேவைப்படுகின்றன.அத்தகைய துல்லியமான சாதனங்கள் தேவைப்படாத பல நுட்பங்கள் உருவாக்கப்பட்டுள்ளன, மேலும் அவை எளிய நீர் குளியல் அல்லது ஆர்வமுள்ள செல்களுக்குள் கூட செய்யப்படலாம்.இந்த நுட்பங்கள் கூட்டாக சமவெப்ப பெருக்கம் என்று அழைக்கப்படுகின்றன மற்றும் அதிவேக, நேரியல் அல்லது அடுக்கு பெருக்கத்தின் அடிப்படையில் செயல்படுகின்றன.

சமவெப்ப பெருக்கத்தின் சிறந்த அறியப்பட்ட வகை லூப்-மத்தியஸ்த சமவெப்ப பெருக்கம் அல்லது LAMP ஆகும்.டெம்ப்ளேட் டிஎன்ஏ அல்லது ஆர்என்ஏவைப் பெருக்க LAMP 65⁰C இல் அதிவேகப் பெருக்கத்தைப் பயன்படுத்துகிறது.LAMP ஐச் செய்யும்போது, ​​புதிய டிஎன்ஏவை ஒருங்கிணைக்க டிஎன்ஏ பாலிமரேஸுடன் இலக்கு டிஎன்ஏவின் பகுதிகளுக்கு நான்கு முதல் ஆறு ப்ரைமர்கள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.இவற்றில் இரண்டு ப்ரைமர்கள் மற்ற ப்ரைமர்களில் உள்ள வரிசைகளை அடையாளம் கண்டு அவற்றை பிணைக்கும் பாராட்டு வரிசைகளைக் கொண்டுள்ளன, இது புதிதாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவில் ஒரு "லூப்" கட்டமைப்பை உருவாக்க அனுமதிக்கிறது, இது அடுத்தடுத்த சுற்று பெருக்கங்களில் ப்ரைமர் அனீலிங்க்கு உதவுகிறது.ஃப்ளோரசன்ஸ், அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் அல்லது கலர்மெட்ரி உள்ளிட்ட பல முறைகள் மூலம் LAMP ஐ காட்சிப்படுத்தலாம்.வண்ண அளவீடு மூலம் தயாரிப்பின் இருப்பு அல்லது இல்லாமையைக் காட்சிப்படுத்துவது மற்றும் கண்டறிவது மற்றும் விலையுயர்ந்த உபகரணங்களின் பற்றாக்குறை ஆகியவை மருத்துவ ஆய்வக சோதனைகள் உடனடியாக கிடைக்காத பகுதிகளில் LAMP ஐ SARS-CoV-2 சோதனைக்கு ஏற்ற விருப்பமாக மாற்றியது, அல்லது மாதிரிகளின் சேமிப்பு மற்றும் போக்குவரத்து. இது சாத்தியமில்லை, அல்லது முன்பு PCR தெர்மோசைக்ளிங் கருவி இல்லாத ஆய்வகங்களில்.