Ⅰ. எதிர்வினை அமைப்பின் உணர்திறனை அதிகரிக்கவும்:

1. தனி உயர்தர RNA:

வெற்றிகரமான சிடிஎன்ஏ தொகுப்பு உயர்தர ஆர்என்ஏவில் இருந்து வருகிறது.உயர்தர RNA ஆனது குறைந்தபட்சம் ஒரு மொத்த நீளத்தையாவது உறுதிசெய்ய வேண்டும் மற்றும் EDTA அல்லது SDS போன்ற ரெக்கார்டிங் என்சைம்களைக் கொண்டிருக்காத தடுப்பான்களைக் கொண்டிருக்கவில்லை.ஆர்என்ஏ தரமானது, சிடிஎன்ஏவில் நீங்கள் படியெடுக்கக்கூடிய வரிசைத் தகவலின் அதிகபட்ச மதிப்பைத் தீர்மானிக்கிறது.பொது ஆர்.என்.ஏ சுத்திகரிப்பு முறை என்பது ஐசோசயனேட்/அசிடோபீனாலைப் பயன்படுத்துவதற்கான ஒரு படி முறையாகும்.RNase மாசுபடுவதைத் தடுப்பதற்காக, RNase (கணையம் போன்றவை) நிறைந்த மாதிரியிலிருந்து பிரிக்கப்பட்ட RNA க்கு உயர்தர RNA ஐச் சேமிக்க ஃபார்மால்டிஹைட்டின் சேமிப்பு தேவைப்படுகிறது, இது நீண்ட கால சேமிப்பிற்கு இன்னும் அதிகமாகும்.எலி கல்லீரலில் இருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏ அடிப்படையில் ஒரு வாரம் தண்ணீரில் சேமித்து வைத்த பிறகு சிதைக்கப்பட்டது, அதே சமயம் எலி மண்ணீரலில் இருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏ மூன்று வருடங்கள் தண்ணீரில் சேமித்து வைத்த பிறகு நிலையானதாக இருந்தது.கூடுதலாக, சிறிய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளை விட 4kb ஐ விட பெரிய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் RNase சிதைவைக் கண்டறிய அதிக உணர்திறன் கொண்டவை.சேமிப்பக ஆர்என்ஏ மாதிரியின் நிலைத்தன்மையை அதிகரிக்க, ஆர்என்ஏவை அயனியின் மெத்தால்மமைனில் கரைத்து, -70 டிகிரி செல்சியஸ் சேமிக்கப்படும்.ஆர்என்ஏவைச் சேமிக்கப் பயன்படுத்தப்படும் தைலைடில் ஆர்என்ஏவைச் சிதைக்கும் இதர பொருள் இருக்கக்கூடாது.கணையத்தில் இருந்து பெறப்படும் ஆர்.என்.ஏ, குறைந்தபட்சம் ஒரு வருடத்திற்கு மெத்தால்மாமினில் சேமிக்கப்படும்.நீங்கள் ஆர்என்ஏவைப் பயன்படுத்தத் தயாரானதும், ஆர்என்ஏவைப் படியெடுக்க பின்வரும் முறைகளைப் பயன்படுத்தலாம்: NaCl ஐ 0.2m மற்றும் எத்தனாலின் 4 மடங்கு அளவுக்குச் சேர்க்கவும், அறை வெப்பநிலையை 3-5 நிமிடங்களுக்கு வைக்கவும், 10,000 × g மையவிலக்கு 5 நிமிடங்களுக்கு வைக்கவும்.

2. RNaseH செயல்பாடு (RNaseH-) இல்லாமல் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸைப் பயன்படுத்தவும்:

சிடிஎன்ஏ தொகுப்பின் நீளம் மற்றும் விளைச்சலை அதிகரிக்க RNase தடுப்பான்கள் பெரும்பாலும் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் எதிர்வினைகளில் சேர்க்கப்படுகின்றன.RNase இன்ஹிபிட்டர், இடையகங்கள் மற்றும் DTT போன்ற குறைப்பு முகவர்கள் முன்னிலையில் முதல் சங்கிலித் தொகுப்பு வினையில் சேர்க்கப்படுகிறது, ஏனெனில் முன்-சிடிஎன்ஏ தொகுப்பு செயல்முறை தடுப்பானைக் குறைத்து, அதன் மூலம் ஆர்என்ஏவைச் சிதைக்கும் கட்டுப்பட்ட ஆர்நேஸ்களை வெளியிடுகிறது.புரோட்டீன் RNase இன்ஹிபிட்டர் RNase A, B, C ஆகியவற்றால் RNA சிதைவதைத் தடுக்கிறது, மேலும் தோலில் RNaseகளைத் தடுக்காது, எனவே இந்த தடுப்பான்களைப் பயன்படுத்தினாலும் விரல்களில் இருந்து RNases ஐ அறிமுகப்படுத்தாமல் கவனமாக இருக்க வேண்டும்.

ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் ஆர்என்ஏவை சிடிஎன்ஏவாக மாற்றுவதற்கு ஊக்கமளிக்கிறது.M-MLV மற்றும் AMV இரண்டும் அவற்றின் சொந்த பாலிமரேஸ் செயல்பாட்டிற்கு கூடுதலாக உள்நோக்கிய RNaseH செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளன.RNaseH செயல்பாடு RNA வார்ப்புருக்கள் மற்றும் DNA ப்ரைமர்கள் அல்லது cDNA நீட்டிப்பு இழைகளுக்கு இடையே உருவாகும் பன்முகத்தன்மை கொண்ட இழைகளுக்கான பாலிமரேஸ் செயல்பாட்டுடன் போட்டியிடுகிறது, மேலும் DNA வளாகங்களில் RNA: RNA இழைகளை சிதைக்கிறது.RNaseH செயல்பாட்டால் சிதைக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏ டெம்ப்ளேட்டுகள் இனி சிடிஎன்ஏ தொகுப்புக்கான பயனுள்ள அடி மூலக்கூறுகளாகப் பயன்படுத்தப்படாது, இது சிடிஎன்ஏ தொகுப்பின் விளைச்சலையும் நீளத்தையும் குறைக்கிறது.இவ்வாறு ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸின் RNaseH செயல்பாட்டை நீக்குவது அல்லது வெகுவாகக் குறைப்பது பெரும் பயனளிக்கும்.

சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட்Ⅱ ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ், RNaseH-ன் MMLV ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் மற்றும் தெர்மோஸ்கிரிப்ட் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ், RNaseH-ன் AMV ஆனது MMLV மற்றும் AMV ஐ விட முழு நீள சிடிஎன்ஏவைக் கொடுத்தது.RT-PCR உணர்திறன் சிடிஎன்ஏ தொகுக்கப்பட்ட அளவால் பாதிக்கப்படுகிறது.AMV ஐ விட தெர்மோஸ்கிரிப்ட் அதிக உணர்திறன் கொண்டது.RT-PCR தயாரிப்புகளின் அளவு சிடிஎன்ஏவை ஒருங்கிணைக்கும் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸின் திறனால் வரையறுக்கப்படுகிறது, குறிப்பாக பெரிய சிடினாக்களை குளோனிங் செய்யும் போது.MMLV உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​SuperScripⅡ நீண்ட RT-PCR தயாரிப்புகளின் விளைச்சலை கணிசமாக அதிகரித்தது.RNaseH-ன் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் வெப்ப நிலைத்தன்மையையும் அதிகரிக்கிறது, எனவே வினையானது 37-42℃ இயல்பை விட அதிக வெப்பநிலையில் மேற்கொள்ளப்படலாம்.பரிந்துரைக்கப்பட்ட தொகுப்பு நிலைமைகளின் கீழ், ஒலிகோ(dT) ப்ரைமர்கள் மற்றும் 10μCi [alpha-p]dCTP ஆகியவை பயன்படுத்தப்பட்டன.முதல் சங்கிலியின் மொத்த உற்பத்தி TCA மழைப்பொழிவு முறையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது.அளவு-வரிசைப்படுத்தப்பட்ட துண்டு அகற்றுதல் மற்றும் அல்கலைன் அகரோஸ் ஜெல்லில் எண்ணுதல் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி முழு நீள சிடிஎன்ஏ பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.

3. தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் வெப்ப பாதுகாப்பு வெப்பநிலையை அதிகரிக்கவும்:

அதிக வைத்திருக்கும் வெப்பநிலை ஆர்.என்.ஏ.வின் இரண்டாம் கட்டமைப்பைத் திறக்கவும், எதிர்வினையின் விளைச்சலை அதிகரிக்கவும் உதவுகிறது.பெரும்பாலான ஆர்என்ஏ டெம்ப்ளேட்டுகளுக்கு, ஆர்என்ஏ மற்றும் ப்ரைமரை 65 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் பஃபர் அல்லது உப்பு இல்லாமல் வைத்திருப்பது மற்றும் பனியில் விரைவாக குளிர்விப்பது பெரும்பாலான இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்புகளை நீக்கி, ப்ரைமர்களை பிணைக்க அனுமதிக்கிறது.இருப்பினும், சில வார்ப்புருக்கள் வெப்பக் குறைப்புக்குப் பிறகும் இரண்டாம் நிலை அமைப்பைக் கொண்டுள்ளன.இந்த கடினமான டெம்ப்ளேட்களின் பெருக்கம், தெர்மோஸ்கிரிப்ட் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸைப் பயன்படுத்தியும், ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் எதிர்வினையை அதிக வெப்பநிலையில் வைப்பதன் மூலமும் பெருக்கத்தை மேம்படுத்தலாம்.அதிக ஹோல்டிங் வெப்பநிலைகள் குறிப்பிட்ட தன்மையை அதிகரிக்கலாம், குறிப்பாக மரபணு-குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்களை (ஜிஎஸ்பிஎஸ்) பயன்படுத்தி சிடிஎன்ஏ தொகுப்பு செய்யப்படும் போது (அத்தியாயம் 3 ஐப் பார்க்கவும்).GSP ஐப் பயன்படுத்தினால், ப்ரைமரின் Tm மதிப்பு எதிர்பார்க்கப்படும் ஹோல்டிங் வெப்பநிலைக்கு சமமாக இருப்பதை உறுதிசெய்யவும்.ஒலிகோ(dT) மற்றும் 60℃க்கு மேல் ரேண்டம் ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்த வேண்டாம்.ரேண்டம் ப்ரைமர்களை 60℃ ஆக அதிகரிக்க 10 நிமிடங்களுக்கு 25℃ இல் வைத்திருக்க வேண்டும்.அதிக ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் வெப்பநிலைகளைப் பயன்படுத்துவதோடு, ஆர்என்ஏ/ப்ரைமர் கலவையை 65℃ டினாட்டரிங் வெப்பநிலையிலிருந்து ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ஹோல்டிங் வெப்பநிலைக்கு நேரடியாக மாற்றுவதன் மூலமும், ப்ரீஹீட் செய்யப்பட்ட 2× ரியாக்ஷன் கலவையைச் சேர்ப்பதன் மூலமும் (சிடிஎன்ஏ வெப்ப துவக்கத் தொகுப்பு) தனித்தன்மையை மேம்படுத்தலாம்.இந்த அணுகுமுறை குறைந்த வெப்பநிலையில் நிகழும் இன்டர்மாலிகுலர் பேஸ் ஜோடியைத் தடுக்க உதவுகிறது.PCR கருவியைப் பயன்படுத்துவது RT-PCRக்கு தேவையான பல வெப்பநிலை சுவிட்சுகளை எளிதாக்குகிறது.

Tth வெப்ப நிலைப்படுத்தப்பட்ட பாலிமரேஸ் Mg2+ முன்னிலையில் DNA பாலிமரேஸாகவும், Mn2+ முன்னிலையில் RNA பாலிமரேஸாகவும் செயல்படுகிறது.இது 65℃ வரை வெப்பத்தைத் தாங்கும்.இருப்பினும், PCR இன் போது Mn2+ இருப்பது நம்பகத்தன்மையைக் குறைக்கிறது, இது சிடிஎன்ஏ குளோனிங் போன்ற உயர் துல்லியமான பெருக்கத்திற்கு Tth பாலிமரேஸைப் பொருத்தமற்றதாக ஆக்குகிறது.கூடுதலாக, ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனில் Tth குறைவான செயல்திறன் கொண்டது, இது உணர்திறனைக் குறைக்கிறது, மேலும் ஒரு நொதி தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் PCR ஐச் செய்ய முடியும் என்பதால், தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் இல்லாத கட்டுப்பாட்டு எதிர்வினைகள் cDNA இன் பெருக்கப்பட்ட தயாரிப்புகளை அசுத்தமான மரபணு DNAவிலிருந்து வேறுபடுத்துவதற்குப் பயன்படுத்த முடியாது.

4. தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனை ஊக்குவிக்கும் சேர்க்கை:

கிளிசரின் மற்றும் டிஎம்எஸ்ஓ உள்ளிட்ட சேர்க்கைகளைச் சேர்ப்பது, முதல் சங்கிலித் தொகுப்பு எதிர்வினைக்கு நியூக்ளிக் அமிலம் இரட்டை இழையின் நிலைத்தன்மையைக் குறைத்து, ஆர்என்ஏ இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பை அவிழ்த்துவிடும்.SuperScriptⅡ அல்லது MMLV இன் செயல்பாட்டை பாதிக்காமல் 20% கிளிசரின் அல்லது 10% DMSO வரை சேர்க்கலாம்.AMV ஆனது 20% கிளிசரால் செயல்பாட்டைக் குறைக்காமல் பொறுத்துக்கொள்ளும்.சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட்Ⅱ தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் வினையில் RT-PCR இன் உணர்திறனை அதிகரிக்க, 10% கிளிசரால் சேர்க்கப்பட்டு 45℃ இல் காப்பிடப்படும்.பிசிஆரில் ரெட்ரோட்ரான்ஸ்கிரிப்ஷன்-ரியாக்ஷன் தயாரிப்பில் 1/10 சேர்க்கப்பட்டால், பெருக்க வினையில் கிளிசரால் செறிவு 0.4% ஆகும், இது பிசிஆரைத் தடுக்க போதுமானதாக இல்லை.

5. RNaseH செயலாக்கம்:

PCR க்கு முன் RNaseH உடன் சிடிஎன்ஏ தொகுப்பு எதிர்வினைகளுக்கு சிகிச்சையளிப்பதன் மூலம் உணர்திறனை மேம்படுத்தலாம்.சில டெம்ப்ளேட்டுகளுக்கு, சிடிஎன்ஏ தொகுப்பு வினையில் உள்ள ஆர்என்ஏ பெருக்கப்பட்ட தயாரிப்புகளை பிணைப்பதைத் தடுக்கிறது என்று கருதப்படுகிறது, இதில் RNaseH சிகிச்சையானது உணர்திறனை அதிகரிக்கும்.பொதுவாக, RNaseH சிகிச்சையானது ஒப்பீட்டளவில் நீண்ட முழு நீள சிடிஎன்ஏ இலக்கு டெம்ப்ளேட்டைப் பெருக்குவதற்குத் தேவைப்படுகிறது, அதாவது டியூபரஸ் ஸ்கிரோசிஸ்Ⅱ குறைந்த நகலுடன்.இந்த கடினமான டெம்ப்ளேட்டிற்கு, சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட்Ⅱ அல்லது AMV மூலம் சிடிஎன்ஏ மூலம் உருவாக்கப்பட்ட சிக்னலை RNaseH மேம்படுத்தியது.பெரும்பாலான RT-PCR எதிர்வினைகளுக்கு, RNaseH சிகிச்சை விருப்பமானது, ஏனெனில் 95℃ இன்சுலேட்டட் PCR denaturation படி பொதுவாக RNA: DNA வளாகத்திலிருந்து RNA ஐ ஹைட்ரோலைஸ் செய்கிறது.

6. சிறிய அளவிலான ஆர்என்ஏவைக் கண்டறிவதற்கான மேம்படுத்தப்பட்ட முறைகள்:

ஆர்.டி.-பி.சி.ஆர் குறிப்பாக சிறிய அளவிலான ஆர்.என்.ஏ கிடைக்கும் போது சவாலானது.ஆர்.என்.ஏ பிரிக்கும் போது கிளைகோஜனை ஒரு கேரியராக சேர்ப்பது சிறிய மாதிரிகளின் விளைச்சலை அதிகரிக்க உதவுகிறது.டிரைசோலின் அதே நேரத்தில் RNase-இலவச கிளைகோஜனையும் சேர்க்கலாம்.கிளைகோஜன் நீரில் கரையக்கூடியது மற்றும் ஆர்.என்.ஏ உடன் நீர் நிலையில் தொடர்ந்து மழைப்பொழிவுக்கு உதவும்.RNase-இலவச கிளைகோஜனின் பரிந்துரைக்கப்பட்ட செறிவு 50mg க்கும் குறைவான திசுக்கள் அல்லது 106 வளர்ப்பு உயிரணுக்களுக்கு 250μg/ml ஆகும்.

சூப்பர் ஸ்கிரிப்ட்Ⅱஐப் பயன்படுத்தி, ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் வினைகளுக்கு அசிடைலேட்டட் பிஎஸ்ஏவைச் சேர்ப்பது, உணர்திறனை அதிகரிக்கலாம், மேலும் சிறிய அளவிலான ஆர்என்ஏவுக்கு, சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட்Ⅱ அளவைக் குறைத்து, 40 யூனிட் ஆர்நேஸ்அவுட் நியூக்லீஸ் இன்ஹிபிட்டரைச் சேர்ப்பது கண்டறிதல் அளவை மேம்படுத்தலாம்.ஆர்.என்.ஏ பிரித்தலில் கிளைகோஜன் பயன்படுத்தப்பட்டால், சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட்Ⅱ ஐப் பயன்படுத்தி ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் வினைகளுக்கு BSA அல்லது RNase இன்ஹிபிட்டர்களைச் சேர்ப்பது இன்னும் பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

Ⅱ. RT-PCR இன் தனித்துவத்தை அதிகரிக்கவும்

1. cNDA தொகுப்பு:

முதல் இழை சிடிஎன்ஏ தொகுப்பைத் தொடங்க மூன்று வெவ்வேறு முறைகளைப் பயன்படுத்தலாம், மேலும் ஒவ்வொரு முறையின் ஒப்பீட்டுத் தன்மையும் சிடிஎன்ஏ தொகுக்கப்பட்ட அளவு மற்றும் வகையைப் பாதிக்கிறது.

மூன்று முறைகளில் ரேண்டம் ப்ரைமர் முறை மிகவும் குறைவானது.குறுகிய, பகுதி நீளமான சிடிஎன்ஏவை உருவாக்க டிரான்ஸ்கிரிப்ட் முழுவதும் ப்ரைமர்கள் பல தளங்களில் இணைக்கப்படுகின்றன.இந்த முறை 5′ டெர்மினல் சீக்வென்ஸ்கள் மற்றும் சிடிஎன்ஏவை RNA டெம்ப்ளேட்களில் இருந்து இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பு பகுதிகள் அல்லது ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் நகலெடுக்க முடியாத டெர்மினேட்டிங் தளங்களில் இருந்து பெற பயன்படுத்தப்படுகிறது.மிக நீளமான சிடிஎன்ஏவைப் பெற, ஒவ்வொரு ஆர்என்ஏ மாதிரியிலும் ப்ரைமர்களின் ஆர்என்ஏ விகிதத்தை அனுபவ ரீதியாக தீர்மானிக்க வேண்டும்.சீரற்ற ப்ரைமர்களின் ஆரம்ப செறிவு 20μl எதிர்வினை அமைப்புக்கு 50 முதல் 250ng வரை இருக்கும்.ரேண்டம் ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி மொத்த RNA இலிருந்து ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட சிடிஎன்ஏ முக்கியமாக ரைபோசோமால் ஆர்என்ஏவாக இருப்பதால், பாலி(ஏ)+ஆர்என்ஏ பொதுவாக டெம்ப்ளேட்டாகத் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகிறது.

ரேண்டம் ப்ரைமர்களை விட ஒலிகோ(dT) துவக்கம் மிகவும் குறிப்பிட்டது.பெரும்பாலான யூகாரியோடிக் செல்களில் mRNAயின் 3′ இறுதியில் காணப்படும் பாலி(A) வால் உடன் இது கலப்பினமாக்குகிறது.பாலி(A)+ஆர்என்ஏ மொத்த ஆர்என்ஏவில் தோராயமாக 1% முதல் 2% வரை இருப்பதால், சிடிஎன்ஏவின் அளவு மற்றும் சிக்கலானது சீரற்ற ப்ரைமர்கள் பயன்படுத்தப்பட்டதை விட மிகக் குறைவு.அதன் அதிக விவரக்குறிப்பு காரணமாக, ஒலிகோ(dT) க்கு பொதுவாக ஆர்என்ஏ முதல் ப்ரைமர் விகிதம் மற்றும் பாலி(A)+ தேர்வுக்கான தேர்வுமுறை தேவையில்லை.20μl எதிர்வினை அமைப்புக்கு 0.5μg ஒலிகோ(dT) பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.ஒலிகோ(dT)12-18 பெரும்பாலான RT-PCRக்கு ஏற்றது.தெர்மோஸ்கிரிப்ட் RT-PCR சிஸ்டம் ஒலிகோ(dT)20ஐ வழங்குகிறது, ஏனெனில் அதன் நல்ல வெப்ப நிலைப்புத்தன்மை மற்றும் அதிக வெப்பநிலைக்கு ஏற்றது.

மரபணு-குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள் (GSP) தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் படிக்கான சிறந்த குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள் ஆகும்.ஜிஎஸ்பி என்பது ஒரு ஆன்டிசென்ஸ் ஒலிகோநியூக்ளியோசைடு ஆகும், இது ரேண்டம் ப்ரைமர்கள் அல்லது ஒலிகோ(டிடி) போன்ற அனைத்து ஆர்என்ஏக்களையும் அழிப்பதை விட, ஆர்என்ஏ இலக்கு வரிசைகளுடன் குறிப்பாக கலப்பினமாக்கும்.பிசிஆர் ப்ரைமர்களை வடிவமைக்கப் பயன்படுத்தப்படும் விதிகள், ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ரியாக்ஷன் ஜிஎஸ்பி வடிவமைப்பிற்கும் பொருந்தும்.GSP ஆனது mRNA3′ இன் இறுதியில் இணைக்கப்பட்ட பெருக்கப் ப்ரைமரின் அதே வரிசையாக இருக்கலாம் அல்லது GSP ஆனது ரிவர்ஸ் ஆம்ப்ளிஃபிகேஷன் ப்ரைமருடன் கீழ்நோக்கி இணைக்கப்படும் வகையில் வடிவமைக்கப்படலாம்.சில பெருக்கப்பட்ட பொருள்களுக்கு, வெற்றிகரமான RT-PCR க்கு ஒன்றுக்கு மேற்பட்ட ஆன்டிசென்ஸ் ப்ரைமரை வடிவமைக்க வேண்டும், ஏனெனில் இலக்கு RNA இன் இரண்டாம் நிலை அமைப்பு ப்ரைமரை பிணைப்பதைத் தடுக்கலாம்.20μl இன் முதல் சங்கிலித் தொகுப்பு எதிர்வினை அமைப்பில் 1pmol ஆன்டிசென்ஸ் GSP ஐப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

2. தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் வெப்ப பாதுகாப்பு வெப்பநிலையை அதிகரிக்கவும்:

ஜிஎஸ்பி விவரக்குறிப்பை முழுமையாகப் பயன்படுத்த, உயர் வெப்ப நிலைத்தன்மையுடன் கூடிய ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் பயன்படுத்தப்பட வேண்டும்.வெப்ப-நிலையான தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் எதிர்வினை கடினத்தன்மையை அதிகரிக்க அதிக வெப்பநிலையில் தனிமைப்படுத்தப்படலாம்.எடுத்துக்காட்டாக, ஒரு GSP 55°C இல் இணைக்கப்பட்டால், AMV அல்லது M-MLV ஐப் பயன்படுத்தி குறைந்த கடுமையுடன் 37°C இல் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செய்யப்பட்டால், GSPயின் தனித்தன்மை முழுமையாகப் பயன்படுத்தப்படாது.இருப்பினும், SuperScripⅡ மற்றும் ThermoScript ஆகியவை 50℃ அல்லது அதற்கும் அதிகமான வெப்பநிலையில் வினைபுரியும், இது குறைந்த வெப்பநிலையில் உற்பத்தி செய்யப்படும் குறிப்பிடப்படாத தயாரிப்புகளை நீக்குகிறது.அதிகபட்ச விவரக்குறிப்புக்கு, ஆர்என்ஏ/ப்ரைமர் கலவையை 65℃ டீனாட்டரேஷன் வெப்பநிலையில் இருந்து நேரடியாக ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ஹோல்டிங் வெப்பநிலைக்கு முன்சூடேற்றப்பட்ட 2 x எதிர்வினை கலவையுடன் (சிடிஎன்ஏ தொகுப்பின் வெப்ப துவக்கம்) கூடுதலாக மாற்றலாம்.இது குறைந்த வெப்பநிலையில் மூலக்கூறுகளுக்கு இடையே அடிப்படை இணைவதைத் தடுக்க உதவுகிறது.PCR கருவியைப் பயன்படுத்துவது RT-PCRக்கு தேவையான பல வெப்பநிலை மாற்றங்களை எளிதாக்குகிறது.

3. மரபணு DNA மாசுபாட்டைக் குறைத்தல்:

RT-PCR இல் உள்ள ஒரு சாத்தியமான சிரமம் என்னவென்றால், RNA மரபணு DNAவை மாசுபடுத்துகிறது.டிரைசோல் ரீஜென்ட் போன்ற சிறந்த ஆர்என்ஏ பிரிப்பு முறைகளின் பயன்பாடு, ஆர்என்ஏ தயாரிப்புகளில் மரபணு டிஎன்ஏ மாசுபாட்டைக் குறைக்கிறது.ஜெனோமிக் டிஎன்ஏவில் இருந்து தயாரிக்கப்படும் தயாரிப்புகளைத் தவிர்க்க, ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கு முன் அசுத்தமான டிஎன்ஏவை அகற்றுவதற்காக ஆர்என்ஏவை பெருக்க தரம் டிஎன்ஏஸ்Ⅰ மூலம் சிகிச்சையளிக்க முடியும்.மாதிரிகள் DNaseⅠ செரிமானத்தை நிறுத்த 10 நிமிடங்களுக்கு 2.0mM EDTA இல் 65℃ இல் வைக்கப்பட்டன.அதிக வெப்பநிலையில் ஏற்படும் மெக்னீசியம் அயனி சார்ந்த RNA நீராற்பகுப்பைத் தடுக்க EDTA மெக்னீசியம் அயனிகளை செலேட் செய்கிறது.

மரபணு டிஎன்ஏ பெருக்கத் தயாரிப்பில் இருந்து பெருக்கப்பட்ட சிடிஎன்ஏவைப் பிரிப்பதற்காக, பிரிக்கப்பட்ட எக்ஸானுடன் தனித்தனியாக இணைக்கும் ப்ரைமர்களை வடிவமைக்க முடியும்.சிடிஎன்ஏவில் இருந்து பெறப்பட்ட பிசிஆர் தயாரிப்புகள் அசுத்தமான மரபணு டிஎன்ஏவில் இருந்து பெறப்பட்டதை விட குறைவாக இருக்கும்.ஒவ்வொரு ஆர்என்ஏ டெம்ப்ளேட்டிலும் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் இல்லாமல் ஒரு கட்டுப்படுத்தப்பட்ட பரிசோதனை செய்யப்படுகிறது, கொடுக்கப்பட்ட துண்டு மரபணு டிஎன்ஏ அல்லது சிடிஎன்ஏவில் இருந்ததா என்பதை தீர்மானிக்க.தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் இல்லாத நிலையில் பெறப்பட்ட PCR தயாரிப்புகள் மரபணுவிலிருந்து பெறப்படுகின்றன.

தொடர்புடைய தயாரிப்பு

RT-PCR எளிதானது^ᵀᴹநான் (ஒரு படி)

-ஒன்-ஸ்டெப் கிட் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் பிசிஆர் ஆகியவற்றை ஒரே குழாயில் மேற்கொள்ள உதவுகிறது.இது டெம்ப்ளேட் RNA, குறிப்பிட்ட PCR ப்ரைமர்கள் மற்றும் RNase-Free ddH ஆகியவற்றை மட்டுமே சேர்க்க வேண்டும்₂O.

-ஆர்என்ஏவின் நிகழ்நேர அளவு பகுப்பாய்வு விரைவாகவும் துல்லியமாகவும் மேற்கொள்ளப்படலாம்.

-கிட் ஒரு தனித்துவமான Foregene reverse transscription reagent மற்றும் Foregene HotStar Taq DNA பாலிமரேஸ் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்துகிறது, இது ஒரு தனித்துவமான எதிர்வினை அமைப்புடன் இணைந்து வினையின் பெருக்கத் திறன் மற்றும் தனித்தன்மையை திறம்பட மேம்படுத்துகிறது.

-உகந்த எதிர்வினை அமைப்பு எதிர்வினையை அதிக கண்டறிதல் உணர்திறன், வலுவான வெப்ப நிலைத்தன்மை மற்றும் சிறந்த சகிப்புத்தன்மை ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது.

RT Easy II(GDNase உடன்) மாஸ்டர் ப்ரீமிக்ஸ் ஃபர்ஸ்ட்-ஸ்ட்ராண்ட் CDNA தொகுப்புக்கான உண்மையான நேர PCR உடன் GDNase

-ஜிடிஎன்ஏவை அகற்றுவதற்கான திறமையான திறன், இது வார்ப்புருவில் உள்ள ஜிடிஎன்ஏவை 2 நிமிடங்களுக்குள் அகற்றும்.

திறமையான ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் சிஸ்டம், முதல் ஸ்ட்ராண்ட் சிடிஎன்ஏவின் தொகுப்பை முடிக்க 15 நிமிடங்கள் மட்டுமே ஆகும்.

-சிக்கலான வார்ப்புருக்கள்: உயர் GC உள்ளடக்கம் மற்றும் சிக்கலான இரண்டாம் நிலை அமைப்புடன் கூடிய வார்ப்புருக்கள் உயர் செயல்திறனுடன் மாற்றியமைக்கப்படலாம்.

-உயர் உணர்திறன் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் அமைப்பு, pg-நிலை டெம்ப்ளேட்கள் உயர்தர சிடிஎன்ஏவைப் பெறலாம்.

-தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் அமைப்பு அதிக வெப்ப நிலைத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளது, உகந்த எதிர்வினை வெப்பநிலை 42℃, மேலும் இது 50℃ இல் நல்ல தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்திறனைக் கொண்டுள்ளது.