• முகநூல்
  • இணைக்கப்பட்ட
  • வலைஒளி

ஆய்வகத்தில் புதியதாக, குறைந்த மாற்று விகிதத்தைக் கொண்ட தாவரங்களின் கொத்துகளிலிருந்து நேர்மறை தாவரங்களைத் திரையிடுவது நல்ல வேலையல்ல.முதலாவதாக, டிஎன்ஏ ஒரு பெரிய எண்ணிக்கையிலான மாதிரிகளில் இருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட வேண்டும், பின்னர் வெளிநாட்டு மரபணுக்கள் PCR மூலம் கண்டறியப்படும்.இருப்பினும், முடிவுகள் எப்போதாவது சில உருப்படிகளுடன் வெற்றிடங்கள் மற்றும் பட்டைகளாக இருக்கும், ஆனால் தவறவிட்ட கண்டறிதல்கள் அல்லது தவறான கண்டறிதல்கள் உள்ளதா என்பதை தீர்மானிக்க இயலாது..அத்தகைய சோதனை செயல்முறை மற்றும் முடிவுகளை எதிர்கொள்வது மிகவும் உதவியற்றதா?கவலை வேண்டாம், மாற்றுத்திறனாளி பாசிட்டிவ் தாவரங்களை எளிதாகவும் துல்லியமாகவும் எவ்வாறு திரையிடுவது என்பதை சகோதரர் உங்களுக்குக் கற்றுக்கொடுக்கிறார்.

படி 1

வடிவமைப்பு கண்டறிதல் ப்ரைமர்கள்

விரைவு1

சோதிக்கப்பட வேண்டிய மாதிரியின்படி கண்டறியப்பட வேண்டிய எண்டோஜெனஸ் மரபணு மற்றும் வெளிப்புற மரபணுவைத் தீர்மானிக்கவும், மேலும் ப்ரைமர் வடிவமைப்பிற்காக மரபணுவில் ஒரு பிரதிநிதி 100-500bp வரிசையைத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.நல்ல ப்ரைமர்கள் கண்டறிதல் முடிவுகளின் துல்லியத்தை உறுதிசெய்து, கண்டறிதல் நேரத்தைக் குறைக்கலாம் (பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் கண்டறிதல் ப்ரைமர்களுக்கான பிற்சேர்க்கையைப் பார்க்கவும்).

அறிவிப்பு: புதிதாக வடிவமைக்கப்பட்ட ப்ரைமர்கள் எதிர்வினை நிலைமைகளை மேம்படுத்த வேண்டும் மற்றும் பெரிய அளவிலான கண்டறிதலுக்கு முன் கண்டறிதலின் துல்லியம், துல்லியம் மற்றும் கண்டறிதல் வரம்பை சரிபார்க்க வேண்டும்.

படி 2

சோதனை நெறிமுறையை வடிவமைக்கவும்

விரைவு2

நேர்மறை கட்டுப்பாடு: PCR எதிர்வினை அமைப்பு மற்றும் நிலைமைகள் இயல்பானதா என்பதைத் தீர்மானிக்க, இலக்கு துண்டைக் கொண்ட சுத்திகரிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவை டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தவும்.

எதிர்மறை/வெற்று கட்டுப்பாடு: PCR அமைப்பில் மாசுபாட்டின் ஆதாரம் உள்ளதா என்பதைக் கண்டறிய, டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட் அல்லது டிடிஎச்2ஓவை டெம்ப்ளேட்டாக இலக்கு துண்டைக் கொண்டிருக்கவில்லை.

உள் குறிப்புக் கட்டுப்பாடு: PCR மூலம் டெம்ப்ளேட்டைக் கண்டறிய முடியுமா என்பதை மதிப்பீடு செய்ய, சோதனை செய்யப்படும் மாதிரியின் எண்டோஜெனஸ் மரபணுவின் ப்ரைமர்/புரோப் கலவையைப் பயன்படுத்தவும்.

அறிவிப்பு:

சோதனை முடிவுகளின் செல்லுபடியை மதிப்பிட ஒவ்வொரு சோதனைக்கும் நேர்மறை, எதிர்மறை/வெற்று கட்டுப்பாடுகள் மற்றும் உள் கட்டுப்பாட்டு கட்டுப்பாடுகள் அமைக்கப்பட வேண்டும்.

பரிசோதனை தயாரிப்பு

விரைவு3

பயன்படுத்துவதற்கு முன், தீர்வு சமமாக கலக்கப்பட்டுள்ளதா என்பதைக் கவனிக்கவும்.மழைப்பொழிவு கண்டறியப்பட்டால், அதைப் பயன்படுத்துவதற்கு முன் அறிவுறுத்தல்களின்படி கரைத்து கலக்க வேண்டும்.சீரற்ற அயனி விநியோகத்தைத் தவிர்க்க, 2×PCR கலவையை பைப்பெட் செய்து, மைக்ரோபிபெட்டுடன் மீண்டும் மீண்டும் கலக்க வேண்டும்.

அறிவிப்பு:

கையேட்டை வெளியே எடுத்து கவனமாகப் படித்து, கையேட்டின் தேவைகளுக்கு இணங்க பரிசோதனைக்கு முன் தயாரிப்புகளைச் செய்யுங்கள்.

படி 4

PCR எதிர்வினை அமைப்பைத் தயாரிக்கவும்

விரைவு4

சோதனை நெறிமுறையின்படி, ப்ரைமர்கள், H2O மற்றும் 2×PCR கலவையை சமமாக கலந்து, மையவிலக்கு மற்றும் ஒவ்வொரு எதிர்வினை குழாய்க்கும் அவற்றை விநியோகிக்கவும்.

அறிவிப்பு:

பெரிய அளவிலான அல்லது நீண்ட கால சோதனைக்கு, யுஎன்ஜி என்சைம் கொண்ட பிசிஆர் எதிர்வினை அமைப்பைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது, இது பிசிஆர் தயாரிப்புகளால் ஏற்படும் ஏரோசல் மாசுபாட்டை திறம்பட தவிர்க்கலாம்.

படி 5

எதிர்வினை டெம்ப்ளேட்டைச் சேர்க்கவும்

விரைவு5

நேரடி PCR தொழில்நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தி, கடினமான நியூக்ளிக் அமில சுத்திகரிப்பு செயல்முறை தேவையில்லை, மாதிரி டெம்ப்ளேட்டை 10 நிமிடங்களுக்குள் தயார் செய்து, அதனுடன் தொடர்புடைய PCR எதிர்வினை அமைப்பைச் சேர்க்கலாம்.

அறிவிப்பு:

பிளவு முறை சிறந்த கண்டறிதல் விளைவைக் கொண்டுள்ளது, மேலும் பெறப்பட்ட தயாரிப்பு பல கண்டறிதல் எதிர்வினைகளுக்குப் பயன்படுத்தப்படலாம்.

விரைவு6

5.1: இலைகளின் நேரடி விரிவாக்கம்

கையேட்டில் உள்ள படத்தின் அளவின் படி, 2-3 மிமீ விட்டம் கொண்ட இலை திசுக்களை வெட்டி PCR எதிர்வினை அமைப்பில் வைக்கவும்.

குறிப்பு: இலைத் துண்டுகள் PCR எதிர்வினை கரைசலில் முழுமையாக மூழ்கியிருப்பதை உறுதிசெய்து, அதிகப்படியான இலை திசுக்களை சேர்க்க வேண்டாம்.

5.2: இலை பிளவு முறை

5-7 மிமீ விட்டம் கொண்ட இலை திசுக்களை வெட்டி ஒரு மையவிலக்கு குழாயில் வைக்கவும்.நீங்கள் முதிர்ந்த இலைகளைத் தேர்ந்தெடுத்தால், இலையின் முக்கிய நரம்பு திசுக்களைப் பயன்படுத்துவதைத் தவிர்க்கவும்.பைபெட் 50ul பஃபர் பி1 மையவிலக்குக் குழாயில் லைசேட் செய்து, லைசேட் இலை திசுக்களை முழுவதுமாக மூழ்கடித்து, வெப்ப சுழற்சியில் அல்லது உலோகக் குளியலில் வைத்து, 95°C வெப்பநிலையில் 5-10 நிமிடங்களுக்கு லைஸ் செய்ய முடியும்.

விரைவு7

50ul பஃபர் பி2 நியூட்ராலைசேஷன் கரைசலைச் சேர்த்து நன்கு கலக்கவும்.இதன் விளைவாக வரும் லைசேட்டை ஒரு டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தலாம் மற்றும் PCR எதிர்வினை அமைப்பில் சேர்க்கலாம்.

குறிப்பு: வார்ப்புருவின் அளவு PCR அமைப்பில் 5-10% க்கு இடையில் உள்ளது, மேலும் 20% ஐ விட அதிகமாக இருக்கக்கூடாது (உதாரணமாக, 20μl PCR அமைப்பில், 1-2μl லிசிஸ் கரைசலை சேர்க்கவும், 4μl க்கு மேல் இல்லை).

படி 6

PCR எதிர்வினை

விரைவு8

PCR எதிர்வினைக் குழாயை மையவிலக்கு செய்த பிறகு, அது ஒரு PCR கருவியில் பெருக்கத்திற்காக வைக்கப்படுகிறது.

அறிவிப்பு:

எதிர்வினை பெருக்கத்திற்கு சுத்திகரிக்கப்படாத டெம்ப்ளேட்டைப் பயன்படுத்துகிறது, எனவே சுத்திகரிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட்டைப் பயன்படுத்துவதை விட பெருக்க சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை 5-10 சுழற்சிகள் அதிகம்.

படி 7

எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் கண்டறிதல் மற்றும் முடிவு பகுப்பாய்வு

விரைவு9

எம்: 100பிபி டிஎன்ஏ ஏணி

1\4: சுத்திகரிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏ முறை

2\5: நேரடி PCR முறை

3\6: வெற்று கட்டுப்பாடு

QC:

சோதனையில் அமைக்கப்பட்ட பல்வேறு கட்டுப்பாடுகளின் சோதனை முடிவுகள் பின்வரும் நிபந்தனைகளை பூர்த்தி செய்ய வேண்டும்.இல்லையெனில், பிரச்சனைக்கான காரணத்தை பகுப்பாய்வு செய்ய வேண்டும், மேலும் பிரச்சனை நீக்கப்பட்ட பிறகு சோதனை மீண்டும் செய்யப்பட வேண்டும்.

அட்டவணை 1. பல்வேறு கட்டுப்பாட்டு குழுக்களின் இயல்பான சோதனை முடிவுகள்

*பிளாஸ்மிட்டை நேர்மறைக் கட்டுப்பாட்டாகப் பயன்படுத்தும்போது, ​​எண்டோஜெனஸ் மரபணு சோதனை முடிவு எதிர்மறையாக இருக்கலாம்

முடிவு தீர்ப்பு:

A. மாதிரியின் எண்டோஜெனஸ் மரபணுவின் சோதனை முடிவு எதிர்மறையானது, சாதாரண PCR கண்டறிதலுக்கு ஏற்ற DNA மாதிரியிலிருந்து பிரித்தெடுக்க முடியாது அல்லது பிரித்தெடுக்கப்பட்ட DNAவில் PCR எதிர்வினை தடுப்பான்கள் உள்ளன, மேலும் DNA மீண்டும் பிரித்தெடுக்கப்பட வேண்டும் என்பதைக் குறிக்கிறது.

பி. மாதிரியின் எண்டோஜெனஸ் மரபணுவின் சோதனை முடிவு நேர்மறையானது, மேலும் வெளிப்புற மரபணுவின் சோதனை முடிவு எதிர்மறையானது, சாதாரண PCR கண்டறிதலுக்கு ஏற்ற DNA மாதிரியிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்டதைக் குறிக்கிறது, மேலும் XXX மரபணு மாதிரியில் கண்டறியப்படவில்லை என்று தீர்மானிக்கலாம்.

சி. மாதிரியின் எண்டோஜெனஸ் மரபணுவின் சோதனை முடிவு நேர்மறையானது, மேலும் வெளிப்புற மரபணுவின் சோதனை முடிவு நேர்மறையானது, இது சாதாரண PCR கண்டறிதலுக்கு ஏற்ற DNA மாதிரியிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்டதைக் குறிக்கிறது, மேலும் மாதிரி DNA XXX மரபணுவைக் கொண்டுள்ளது.உறுதிப்படுத்தல் சோதனைகள் மேலும் மேற்கொள்ளப்படலாம்.

படி 8

வடிவமைப்பு கண்டறிதல் ப்ரைமர்கள்

விரைவு10

பரிசோதனைக்குப் பிறகு, 2% சோடியம் ஹைபோகுளோரைட் கரைசலையும், 70% எத்தனால் கரைசலையும் பயன்படுத்தி, சுற்றுச்சூழல் மாசுபடுவதைத் தடுக்க, பரிசோதனைப் பகுதியைத் துடைக்க வேண்டும்.


இடுகை நேரம்: செப்-08-2021