RT-qPCR சாதாரண PCR தொழில்நுட்பத்திலிருந்து உருவாக்கப்பட்டது.இது பாரம்பரிய PCR எதிர்வினை அமைப்பில் ஒளிரும் இரசாயனங்கள் (ஃப்ளோரசன்ட் சாயங்கள் அல்லது ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வுகள்) சேர்க்கிறது, மேலும் பிசிஆர் அனீலிங் மற்றும் நீட்டிப்பு செயல்முறையை அவற்றின் வெவ்வேறு ஒளிரும் வழிமுறைகளுக்கு ஏற்ப உண்மையான நேரத்தில் கண்டறிகிறது.பிசிஆரின் ஒவ்வொரு சுழற்சியிலும் தயாரிப்பு மாற்றத்தின் அளவைக் கணக்கிட ஊடகத்தில் ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னல் மாற்றங்கள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.தற்போது, ​​மிகவும் பொதுவான முறைகள் ஃப்ளோரசன்ட் சாய முறை மற்றும் ஆய்வு முறை ஆகும்.

ஃப்ளோரசன்ட் சாய முறை:
SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO போன்ற சில ஃப்ளோரசன்ட் சாயங்கள் தாங்களாகவே ஒளியை வெளியிடுவதில்லை, ஆனால் dsDNAவின் சிறிய பள்ளத்துடன் பிணைக்கப்பட்ட பிறகு ஒளிரும் தன்மையை வெளியிடுகின்றன.எனவே, PCR எதிர்வினையின் தொடக்கத்தில், இயந்திரம் ஒளிரும் சமிக்ஞையை கண்டறிய முடியாது.அனீலிங்-நீட்டிப்பு (இரண்டு-படி முறை) அல்லது நீட்டிப்பு நிலைக்கு (மூன்று-படி முறை) எதிர்வினை தொடரும் போது, ​​இந்த நேரத்தில் இரட்டை இழைகள் திறக்கப்படுகின்றன, மேலும் புதிய டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் ஸ்ட்ராண்ட் தொகுப்பின் போது, ​​ஃப்ளோரசன்ட் மூலக்கூறுகள் டிஎஸ்டிஎன்ஏ சிறிய பள்ளத்தில் இணைக்கப்பட்டு ஒளிரும் தன்மையை வெளியிடுகின்றன.PCR சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை அதிகரிக்கும் போது, ​​மேலும் மேலும் சாயங்கள் dsDNA உடன் இணைகின்றன, மேலும் ஃப்ளோரசன்ட் சமிக்ஞையும் தொடர்ந்து மேம்படுத்தப்படுகிறது.உதாரணமாக SYBR Green Ⅰ ஐ எடுத்துக் கொள்ளுங்கள்.
ஆய்வு முறை:
தக்மான் ஆய்வு என்பது பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் நீராற்பகுப்பு ஆய்வு ஆகும்.ஆய்வின் 5′ முடிவில் ஒரு ஃப்ளோரசன்ட் குழு உள்ளது, பொதுவாக FAM.ஆய்வு என்பது இலக்கு மரபணுவுக்கு நிரப்பு வரிசையாகும்.புளோரோஃபோரின் 3′ முடிவில் ஒரு ஃப்ளோரசன்ட் தணிக்கும் குழு உள்ளது.ஃப்ளோரசன்ஸ் அதிர்வு ஆற்றல் பரிமாற்றத்தின் கொள்கையின்படி (Förster resonance energy transfer, FRET), ரிப்போர்ட்டர் ஃப்ளோரசன்ட் குழுவும் (நன்கொடையாளர் ஃப்ளோரசன்ட் மூலக்கூறு) மற்றும் தணிக்கும் ஃப்ளோரசன்ட் குழுவும் (ஏற்றுக்கொள்ளும் ஃப்ளோரசன்ட் மூலக்கூறு) தூண்டுதல் ஸ்பெக்ட்ரம் ஒன்றுடன் ஒன்று சேரும்போது, ​​7 தூரம் அதிகமாக இருக்கும். ஏற்பி மூலக்கூறின் ஒளிரும் தன்மை, ஆட்டோஃப்ளோரசன்ஸ் பலவீனமடையும் போது.எனவே, PCR எதிர்வினையின் தொடக்கத்தில், ஆய்வு இலவசம் மற்றும் கணினியில் அப்படியே இருக்கும் போது, ​​நிருபர் ஃப்ளோரசன்ட் குழு ஃப்ளோரசன்ஸை வெளியிடாது.அனீலிங் செய்யும் போது, ​​ப்ரைமர் மற்றும் ப்ரோப் ஆகியவை டெம்ப்ளேட்டுடன் பிணைக்கப்படுகின்றன.நீட்டிப்பு கட்டத்தில், பாலிமரேஸ் தொடர்ந்து புதிய சங்கிலிகளை ஒருங்கிணைக்கிறது.டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் 5′-3′ எக்ஸோநியூக்லீஸ் செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளது.ஆய்வை அடையும் போது, ​​டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் டெம்ப்ளேட்டிலிருந்து ஆய்வை ஹைட்ரோலைஸ் செய்யும், ரிப்போர்ட்டர் ஃப்ளோரசன்ட் குழுவை க்வென்சர் ஃப்ளோரசன்ட் குழுவிலிருந்து பிரித்து, ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னலை வெளியிடும்.ஆய்வுக்கும் டெம்ப்ளேட்டிற்கும் இடையே ஒருவருக்கு ஒருவர் தொடர்பு இருப்பதால், சோதனையின் துல்லியம் மற்றும் உணர்திறன் அடிப்படையில் சாய முறையை விட ஆய்வு முறை சிறந்தது.

படம் 1 qRT-PCR இன் கோட்பாடு

ப்ரைமர் வடிவமைப்பு
கொள்கைகள்:

ப்ரைமர்கள் நியூக்ளிக் அமிலத் தொடரின் பாதுகாக்கப்பட்ட பகுதியில் வடிவமைக்கப்பட வேண்டும் மற்றும் குறிப்பிட்ட தன்மையைக் கொண்டிருக்க வேண்டும்.

சிடிஎன்ஏ வரிசையைப் பயன்படுத்துவது சிறந்தது, மேலும் எம்ஆர்என்ஏ வரிசையும் ஏற்கத்தக்கது.இல்லையெனில், டிஎன்ஏ வரிசையின் சிடிஎஸ் பகுதி வடிவமைப்பைக் கண்டறியவும்.
ஃப்ளோரசன்ட் அளவு உற்பத்தியின் நீளம் 80-150bp ஆகும், நீளமானது 300bp ஆகும், ப்ரைமர் நீளம் பொதுவாக 17-25 தளங்களுக்கு இடையில் இருக்கும், மேலும் அப்ஸ்ட்ரீம் மற்றும் கீழ்நிலை ப்ரைமர்களுக்கு இடையே உள்ள வேறுபாடு மிகப் பெரியதாக இருக்கக்கூடாது.

G+C உள்ளடக்கம் 40% முதல் 60% வரை உள்ளது, மேலும் 45-55% சிறந்தது.
டிஎம் மதிப்பு 58-62 டிகிரிக்கு இடையில் உள்ளது.
ப்ரைமர் டைமர்கள் மற்றும் சுய-டைமர்களைத் தவிர்க்க முயற்சிக்கவும், (தொடர்ச்சியான 4 ஜோடிகளுக்கு மேல் நிரப்பு தளங்கள் தோன்றாது) ஹேர்பின் அமைப்பு, தவிர்க்க முடியாவிட்டால், ΔG<4.5kJ/mol* ஐ உருவாக்கவும், தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் போது gDNA அகற்றப்பட்டதை உங்களால் உறுதிப்படுத்த முடியாவிட்டால், GDNA ஐத் தவிர்க்கவும். T/C, A/G தொடர் அமைப்பு (2-3) ப்ரைமர்கள் மற்றும் அல்லாதவை
குறிப்பிட்ட பன்முகத்தன்மை கொண்ட பெருக்கப்பட்ட வரிசையின் ஹோமோலஜி 70% க்கும் குறைவாக அல்லது 8 நிரப்பு அடிப்படை ஹோமோலஜியைக் கொண்டுள்ளது.
தரவுத்தளம்:
முக்கிய வார்த்தைகள் மூலம் CottonFGD தேடல்
முதன்மை வடிவமைப்பு:
IDT-qPCR ப்ரைமர் வடிவமைப்பு

Fig2 IDT ஆன்லைன் ப்ரைமர் வடிவமைப்பு கருவிப் பக்கம்

Fig3 முடிவு பக்கக் காட்சி
lncRNA ப்ரைமர்களின் வடிவமைப்பு:
lncRNA:mRNA போன்ற அதே படிகள்.
மைஆர்என்ஏ:ஸ்டெம்-லூப் முறையின் கொள்கை: அனைத்து மைஆர்என்ஏக்களும் சுமார் 23 என்டியின் குறுகிய வரிசைகளாக இருப்பதால், நேரடி பிசிஆர் கண்டறிதல் செய்ய முடியாது, எனவே ஸ்டெம்-லூப் சீக்வென்ஸ் கருவி பயன்படுத்தப்படுகிறது.ஸ்டெம்-லூப் சீக்வென்ஸ் என்பது சுமார் 50 என்டி கொண்ட ஒரு ஒற்றை இழை டிஎன்ஏ ஆகும், இது தானாகவே ஒரு ஹேர்பின் அமைப்பை உருவாக்க முடியும்.3 'முடிவை மைஆர்என்ஏ பகுதி துண்டிற்கு நிரப்பு வரிசையாக வடிவமைக்க முடியும், பின்னர் இலக்கு மைஆர்என்ஏவை ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் போது ஸ்டெம்-லூப் வரிசையுடன் இணைக்க முடியும், மேலும் மொத்த நீளம் 70 பிபியை எட்டும், இது qPCR ஆல் தீர்மானிக்கப்படும் பெருக்கப்பட்ட உற்பத்தியின் நீளத்திற்கு ஏற்ப இருக்கும்.டெய்லிங் மைஆர்என்ஏ ப்ரைமர் வடிவமைப்பு.
பெருக்கம் சார்ந்த கண்டறிதல்:
ஆன்லைன் குண்டு வெடிப்பு தரவுத்தளம்: வரிசை ஒற்றுமை மூலம் CottonFGD வெடிப்பு
லோக்கல் பிளாஸ்ட்: லோக்கல் ப்ளாஸ்ட் செய்ய Blast+ ஐப் பயன்படுத்தவும், linux மற்றும் macos நேரடியாக உள்ளூர் தரவுத்தளத்தை நிறுவலாம், ubuntu bash ஐ நிறுவிய பிறகும் win10 அமைப்பைச் செய்யலாம்.உள்ளூர் குண்டுவெடிப்பு தரவுத்தளம் மற்றும் உள்ளூர் குண்டு வெடிப்பை உருவாக்கவும்;Win10 இல் உபுண்டு பாஷைத் திறக்கவும்.
குறிப்பு: மேட்டு நில பருத்தி மற்றும் கடல் தீவு பருத்தி ஆகியவை டெட்ராப்ளோயிட் பயிர்கள், எனவே வெடிப்பின் விளைவாக பெரும்பாலும் இரண்டு அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட தீக்குச்சிகள் இருக்கும்.கடந்த காலத்தில், NAU குறுந்தகடுகளை ஒரு தரவுத்தளமாக பயன்படுத்தி குண்டு வெடிப்பை நிகழ்த்துவது ஒரு சில SNP வேறுபாடுகளுடன் இரண்டு ஹோமோலோகஸ் மரபணுக்களைக் கண்டறிய வாய்ப்புள்ளது.வழக்கமாக, இரண்டு ஹோமோலோகஸ் மரபணுக்களை ப்ரைமர் வடிவமைப்பால் பிரிக்க முடியாது, எனவே அவை ஒரே மாதிரியாகக் கருதப்படுகின்றன.வெளிப்படையான இண்டல் இருந்தால், ப்ரைமர் வழக்கமாக இன்டலில் வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது, ஆனால் இது ப்ரைமரின் இரண்டாம் கட்டமைப்பிற்கு வழிவகுக்கும் இலவச ஆற்றல் அதிகமாகிறது, இது பெருக்க திறன் குறைவதற்கு வழிவகுக்கிறது, ஆனால் இது தவிர்க்க முடியாதது.

முதன்மை இரண்டாம் கட்டமைப்பைக் கண்டறிதல்:
படிகள்:திறந்த ஒலிகோ 7 → உள்ளீட்டு டெம்ப்ளேட் வரிசை → சப்-விண்டோவை மூடவும் → சேமி → ப்ரைமரை டெம்ப்ளேட்டில் கண்டறிக, ப்ரைமர் நீளத்தை அமைக்க ctrl+D ஐ அழுத்தவும் → சுய-டைமரைசேஷன் பாடி, ஹெட்டோரோடைமர், ஹேர்பின், பொருத்தமின்மை போன்ற பல்வேறு இரண்டாம் கட்டமைப்புகளை பகுப்பாய்வு செய்யவும். படம்4 ப்ரைமர்களின் கடைசி இரண்டு முடிவுகள்.முன் ப்ரைமரின் விளைவு நன்றாக உள்ளது, வெளிப்படையான டைமர் மற்றும் ஹேர்பின் அமைப்பு இல்லை, தொடர்ச்சியான நிரப்பு தளங்கள் இல்லை, மற்றும் இலவச ஆற்றலின் முழுமையான மதிப்பு 4.5 க்கும் குறைவாக உள்ளது, அதே சமயம் பின் ப்ரைமர் தொடர்ச்சியானதைக் காட்டுகிறது 6 அடிப்படைகள் நிரப்பு, மற்றும் இலவச ஆற்றல் 8.8;கூடுதலாக, 3′ முடிவில் மிகவும் தீவிரமான டைமர் தோன்றும், மேலும் 4 தொடர்ச்சியான தளங்களின் டைமர் தோன்றும்.இலவச ஆற்றல் அதிகமாக இல்லாவிட்டாலும், 3′ டைமர் Chl ஆனது பெருக்கத் தனித்தன்மை மற்றும் பெருக்கத் திறனைப் பெரிதும் பாதிக்கலாம்.கூடுதலாக, ஹேர்பின்கள், ஹீட்டோரோடைமர்கள் மற்றும் பொருத்தமின்மை ஆகியவற்றை சரிபார்க்க வேண்டியது அவசியம்.

Fig3 oligo7 கண்டறிதல் முடிவுகள்
பெருக்க திறன் கண்டறிதல்:
PCR எதிர்வினையின் பெருக்க செயல்திறன் PCR முடிவுகளை தீவிரமாக பாதிக்கிறது.மேலும் qRT-PCR இல், அளவு முடிவுகளுக்கு பெருக்க செயல்திறன் குறிப்பாக முக்கியமானது.எதிர்வினை தாங்கலில் உள்ள பிற பொருட்கள், இயந்திரங்கள் மற்றும் நெறிமுறைகளை அகற்றவும்.ப்ரைமர்களின் தரம் qRT-PCR இன் பெருக்க செயல்திறனில் பெரும் தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது.முடிவுகளின் துல்லியத்தை உறுதி செய்வதற்காக, சார்பு ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவீடு மற்றும் முழுமையான ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவீடு ஆகிய இரண்டும் ப்ரைமர்களின் பெருக்க செயல்திறனைக் கண்டறிய வேண்டும்.பயனுள்ள qRT-PCR பெருக்க செயல்திறன் 85% முதல் 115% வரை உள்ளது என்பது அங்கீகரிக்கப்பட்டுள்ளது.இரண்டு முறைகள் உள்ளன:
1. நிலையான வளைவு முறை:
அ.சிடிஎன்ஏவை கலக்கவும்
பி.சாய்வு நீர்த்தல்
c.qPCR
ஈ.பெருக்க செயல்திறனைக் கணக்கிடுவதற்கான நேரியல் பின்னடைவு சமன்பாடு
2. LinRegPCR
LinRegPCR என்பது நிகழ்நேர RT-PCR தரவை பகுப்பாய்வு செய்வதற்கான ஒரு நிரலாகும், இது SYBR பசுமை அல்லது ஒத்த வேதியியல் அடிப்படையில் அளவு PCR (qPCR) தரவு என்றும் அழைக்கப்படுகிறது.நிரல் அடிப்படை அல்லாத திருத்தப்பட்ட தரவைப் பயன்படுத்துகிறது, ஒவ்வொரு மாதிரியிலும் தனித்தனியாக ஒரு அடிப்படைத் திருத்தத்தைச் செய்கிறது, ஒரு சாளரத்தின் நேரியல் தன்மையைத் தீர்மானிக்கிறது, பின்னர் PCR தரவுத் தொகுப்பின் மூலம் ஒரு நேர்கோட்டில் பொருத்துவதற்கு நேரியல் பின்னடைவு பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்துகிறது.இந்த கோட்டின் சாய்விலிருந்து ஒவ்வொரு தனிப்பட்ட மாதிரியின் PCR செயல்திறன் கணக்கிடப்படுகிறது.ஒரு ஆம்ப்ளிகானுக்கு சராசரி PCR செயல்திறன் மற்றும் ஒரு மாதிரிக்கான Ct மதிப்பு ஆகியவை ஒரு மாதிரிக்கான தொடக்க செறிவைக் கணக்கிடப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன, இது தன்னிச்சையான ஒளிரும் அலகுகளில் வெளிப்படுத்தப்படுகிறது.தரவு உள்ளீடு மற்றும் வெளியீடு எக்செல் விரிதாள் மூலம்.ஒரே மாதிரி
கலவை தேவை, சாய்வு இல்லை
படிகள் தேவை:(எடுத்துக்காட்டு போலே CFX96ஐ எடுத்துக் கொள்ளுங்கள், தெளிவான ABI கொண்ட இயந்திரம் அல்ல)
பரிசோதனை:இது ஒரு நிலையான qPCR பரிசோதனை.
qPCR தரவு வெளியீடு:LinRegPCR இரண்டு வகையான வெளியீட்டு கோப்புகளை அடையாளம் காண முடியும்: RDML அல்லது அளவு பெருக்க முடிவு.உண்மையில், இது இயந்திரத்தின் சுழற்சி எண் மற்றும் ஒளிரும் சமிக்ஞையின் நிகழ்நேர கண்டறிதல் மதிப்பாகும், மேலும் நேரியல் பிரிவு செயல்திறனின் ஒளிரும் மாற்ற மதிப்பை பகுப்பாய்வு செய்வதன் மூலம் பெருக்கம் பெறப்படுகிறது.
தரவு தேர்வு: கோட்பாட்டில், RDML மதிப்பு பயன்படுத்தக்கூடியதாக இருக்க வேண்டும்.மென்பொருளால் RDML ஐ அடையாளம் காண முடியவில்லை என்பது எனது கணினியின் பிரச்சனை என்று மதிப்பிடப்பட்டுள்ளது, எனவே அசல் தரவாக எக்செல் வெளியீட்டு மதிப்பு உள்ளது.மாதிரிகளைச் சேர்ப்பதில் தோல்வி போன்ற தரவின் தோராயமான திரையிடலை முதலில் செய்ய பரிந்துரைக்கப்படுகிறது. வெளியீட்டுத் தரவில் புள்ளிகளை நீக்கலாம் (நிச்சயமாக, அவற்றை நீக்க முடியாது, LinRegPCR இந்த புள்ளிகளை பிற்காலத்தில் புறக்கணிக்கும்)

Fig5 qPCR தரவு ஏற்றுமதி

வேட்பாளர் மாதிரிகளின் படம் 6 தேர்வு

தரவு உள்ளீடு:தகுதி பெருக்க முடிவுகளை திறக்கவும்

linRegPCR தரவு உள்ளீட்டின் Fig7 படிகள்

விளைவாக:மீண்டும் மீண்டும் இல்லை என்றால், எந்த குழுவும் தேவையில்லை.மீண்டும் மீண்டும் இருந்தால், குழுவை மாதிரி குழுவில் திருத்தலாம், மேலும் மரபணுவின் பெயரை அடையாளங்காட்டியில் உள்ளிடலாம், பின்னர் அதே மரபணு தானாகவே குழுவாகும்.இறுதியாக, கோப்பைக் கிளிக் செய்து, எக்செல் ஏற்றுமதி செய்து, முடிவுகளைப் பார்க்கவும்.ஒவ்வொரு கிணற்றின் பெருக்க திறன் மற்றும் R2 முடிவுகள் காட்டப்படும்.இரண்டாவதாக, நீங்கள் குழுக்களாகப் பிரித்தால், சரி செய்யப்பட்ட சராசரி பெருக்க செயல்திறன் காட்டப்படும்.ஒவ்வொரு ப்ரைமரின் பெருக்க திறன் 85% முதல் 115% வரை இருப்பதை உறுதிசெய்யவும்.இது மிகவும் பெரியதாகவோ அல்லது மிகச் சிறியதாகவோ இருந்தால், ப்ரைமரின் பெருக்க செயல்திறன் மோசமாக உள்ளது என்று அர்த்தம்.

படம் 8 முடிவு மற்றும் தரவு வெளியீடு

பரிசோதனை செயல்முறை:
ஆர்என்ஏ தரத் தேவைகள்:
தூய்மை:1.72.0 எஞ்சிய ஐசோதியோசயனேட் இருக்கலாம் என்பதைக் குறிக்கிறது.சுத்தமான நியூக்ளிக் அமிலம் A260/A230 சுமார் 2 ஆக இருக்க வேண்டும். 230 nm இல் வலுவான உறிஞ்சுதல் இருந்தால், பினேட் அயனிகள் போன்ற கரிம சேர்மங்கள் இருப்பதைக் குறிக்கிறது.கூடுதலாக, இது 1.5% அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் கண்டறியப்படலாம்.மார்க்கரை சுட்டி, ஏனெனில் ssRNA க்கு டீனாட்டரேஷன் இல்லை மற்றும் மூலக்கூறு எடை மடக்கைக்கு நேரியல் தொடர்பு இல்லை, மேலும் மூலக்கூறு எடையை சரியாக வெளிப்படுத்த முடியாது.செறிவு: கோட்பாட்டளவில்இல்லை100ng/ul க்கும் குறைவாக, செறிவு மிகக் குறைவாக இருந்தால், தூய்மை பொதுவாக உயரம் குறைவாக இருக்கும்

Fig9 RNA ஜெல்

கூடுதலாக, மாதிரி விலைமதிப்பற்றதாக இருந்தால் மற்றும் ஆர்என்ஏ செறிவு அதிகமாக இருந்தால், பிரித்தெடுத்த பிறகு அதை அலிகோட் செய்ய பரிந்துரைக்கப்படுகிறது, மேலும் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்காக 100-300ng/ul என்ற இறுதி செறிவுக்கு RNA ஐ நீர்த்துப்போகச் செய்யவும்.இல்தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்முறை, எம்ஆர்என்ஏ படியெடுத்தால், பாலிஏ டெயில்களுடன் குறிப்பாக பிணைக்கக்கூடிய ஒலிகோ (டிடி) ப்ரைமர்கள் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்குப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன, அதே சமயம் எல்என்சிஆர்என்ஏ மற்றும் சர்க்ஆர்என்ஏ ஆகியவை மொத்த ஆர்என்ஏவின் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கு ரேண்டம் ஹெக்ஸாமர் (ரேண்டம் 6 மெர்) ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்துகின்றன.பல நிறுவனங்கள் தற்போது சிறப்பு டெயிலிங் கிட்களை அறிமுகப்படுத்தியுள்ளன.ஸ்டெம்-லூப் முறையைப் பொறுத்தவரை, டெயில்லிங் முறை மிகவும் வசதியானது, உயர்-செயல்திறன் மற்றும் மறுஉருவாக்கம்-சேமிப்பு ஆகும், ஆனால் ஒரே குடும்பத்தின் மைஆர்என்ஏக்களை வேறுபடுத்துவதன் விளைவு ஸ்டெம்-லூப் முறையைப் போல சிறப்பாக இருக்கக்கூடாது.ஒவ்வொரு தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் கிட் மரபணு-குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்களின் (ஸ்டெம்-லூப்ஸ்) செறிவுக்கான தேவைகளைக் கொண்டுள்ளது.miRNA க்கு பயன்படுத்தப்படும் உள் குறிப்பு U6 ஆகும்.ஸ்டெம்-லூப் இன்வெர்ஷன் செயல்பாட்டில், U6 இன் குழாய் தனித்தனியாக மாற்றப்பட வேண்டும், மேலும் U6 இன் முன் மற்றும் பின் ப்ரைமர்கள் நேரடியாக சேர்க்கப்பட வேண்டும்.சர்க்ஆர்என்ஏ மற்றும் எல்என்சிஆர்என்ஏ இரண்டும் எச்கேஜிகளை அகக் குறிப்பாகப் பயன்படுத்தலாம்.இல்சிடிஎன்ஏ கண்டறிதல்,
RNA உடன் எந்த பிரச்சனையும் இல்லை என்றால், cDNA நன்றாக இருக்க வேண்டும்.இருப்பினும், பரிசோதனையின் முழுமையைப் பின்தொடர்ந்தால், ஜிடிஎன்ஏவை குறுந்தகடுகளிலிருந்து வேறுபடுத்தக்கூடிய உள் குறிப்பு மரபணுவை (குறிப்பு ஜீன், ஆர்ஜி) பயன்படுத்துவது சிறந்தது.பொதுவாக, RG ஒரு வீட்டு பராமரிப்பு மரபணு., HKG) படம் 10 இல் காட்டப்பட்டுள்ளது;அந்த நேரத்தில், நான் சோயாபீன் சேமிப்பக புரதத்தை தயாரித்துக்கொண்டிருந்தேன், மேலும் உள் குறிப்பாக இன்ட்ரான்களைக் கொண்ட Actin7 ஐப் பயன்படுத்தினேன்.ஜிடிஎன்ஏவில் இந்த ப்ரைமரின் பெருக்கப்பட்ட துண்டின் அளவு 452 பிபி, மற்றும் சிடிஎன்ஏ ஒரு டெம்ப்ளேட்டாக பயன்படுத்தப்பட்டால், அது 142 பிபி.பின்னர் சோதனை முடிவுகள் சிடிஎன்ஏவின் ஒரு பகுதி உண்மையில் ஜிடிஎன்ஏவால் மாசுபட்டது என்பதைக் கண்டறிந்தது, மேலும் இது ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் முடிவில் எந்த பிரச்சனையும் இல்லை என்பதை நிரூபித்தது, மேலும் இது பிசிஆருக்கான டெம்ப்ளேட்டாக பயன்படுத்தப்படலாம்.சிடிஎன்ஏவுடன் நேரடியாக அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸை இயக்குவது பயனற்றது, மேலும் இது ஒரு பரவலான இசைக்குழு, இது நம்பத்தகுந்ததாக இல்லை.

படம் 10 cDNA கண்டறிதல்

qPCR நிபந்தனைகளை தீர்மானித்தல்கிட்டின் நெறிமுறையின்படி பொதுவாக எந்த பிரச்சனையும் இல்லை, முக்கியமாக tm மதிப்பின் படியில்.ப்ரைமர் வடிவமைப்பின் போது சில ப்ரைமர்கள் சரியாக வடிவமைக்கப்படவில்லை என்றால், tm மதிப்புக்கும் கோட்பாட்டு 60°Cக்கும் இடையே பெரிய வித்தியாசம் ஏற்பட்டால், cDNA மாதிரிகள் கலந்த பிறகு, கிரேடியன்ட் PCRஐ ப்ரைமர்களுடன் இயக்கி, பட்டைகள் இல்லாமல் வெப்பநிலையை TM மதிப்பாக அமைப்பதைத் தவிர்க்க முயற்சிக்கவும்.

தரவு பகுப்பாய்வு

வழக்கமான ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவு PCR செயலாக்க முறை அடிப்படையில் 2 படி உள்ளது-ΔΔCT.தரவு செயலாக்க டெம்ப்ளேட்.

தொடர்புடைய தயாரிப்புகள்:

நிகழ்நேர PCR எளிதானது^TM -தக்மான்

நிகழ்நேர PCR எளிதானது^TM - சைபர் கிரீன் ஐ

ஆர்டி ஈஸி I (முதல் ஸ்ட்ராண்ட் சிடிஎன்ஏ தொகுப்புக்கான மாஸ்டர் பிரீமிக்ஸ்)

ஆர்டி ஈஸி II (qPCRக்கான முதல் ஸ்ட்ராண்ட் சிடிஎன்ஏ தொகுப்புக்கான மாஸ்டர் பிரீமிக்ஸ்)