COVID-19 என்பது கடுமையான கடுமையான சுவாச நோய்க்குறி கொரோனா வைரஸ் வகை 2 ஆல் ஏற்படும் ஒரு தொற்று நோயாகும். ஒரு நபர் பாதிக்கப்பட்டால், காய்ச்சல், இருமல் மற்றும் மூச்சுத் திணறல் ஆகியவை மிகவும் பொதுவான அறிகுறிகளாகும்.

சோதனைக்கு பயன்படுத்தப்படும் மாதிரிகள் நாசோபார்னீஜியல் ஸ்வாப்ஸ் அல்லது ஓரோபார்னீஜியல் ஸ்வாப்ஸ் மூலம் சேகரிக்கப்படலாம்.

PCR என்றால் என்ன?

கொரோனா வைரஸ் கண்டறிவதற்கான நிலையான முறை பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினை, PCR ஆகும்.இது மூலக்கூறு உயிரியலில் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு முறையாகும்.இது மில்லியன் கணக்கான கோடிக்கணக்கான குறிப்பிட்ட DNA துண்டுகளை விரைவாக நகலெடுக்க முடியும்.

புதிய கொரோனா வைரஸில் மிக நீண்ட ஒற்றை இழை கொண்ட RNA மரபணு உள்ளது.PCR மூலம் இந்த வைரஸ்களைக் கண்டறிவதற்கு, RNA மூலக்கூறுகள் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் மூலம் அவற்றின் நிரப்பு DNA வரிசைகளாக மாற்றப்பட வேண்டும், பின்னர் புதிதாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட DNAவை நிலையான PCR நடைமுறைகள் மூலம் பெருக்க முடியும், இது பொதுவாக RT-PCR என அழைக்கப்படுகிறது.

RT-PCR செயல்முறை

ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல்

இந்த முறையைச் செய்ய, வைரஸ் ஆர்என்ஏ அடிப்படையில் பிரித்தெடுக்கப்பட வேண்டும்.பலவிதமான ஆர்என்ஏ சுத்திகரிப்பு கருவிகள் வசதியான, வேகமான மற்றும் பயனுள்ள பிரிப்புக்கு பயன்படுத்தப்படலாம்.

வணிகக் கருவியைப் பயன்படுத்தி வைரல் ஆர்என்ஏவைப் பிரித்தெடுக்க, முதலில் மாதிரியை மைக்ரோ சென்ட்ரிபியூஜ் குழாயில் சேர்த்து, பின்னர் அதை லிசிஸ் பஃபருடன் கலக்கவும்.இந்த தாங்கல் மிகவும் சிதைந்துள்ளது மற்றும் பொதுவாக பீனால் மற்றும் குவானிடைன் ஐசோதியோசயனேட் ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது.கூடுதலாக, RNase இன்ஹிபிட்டர்கள் பொதுவாக சிதைவு இடையகத்தில் அப்படியே வைரஸ் ஆர்என்ஏவை தனிமைப்படுத்துவதை உறுதிசெய்யும்.

லிசிஸ் பஃப்பரைச் சேர்த்த பிறகு, கலவைக் குழாயை துடிப்பு மூலம் சுழற்றி அறை வெப்பநிலையில் அடைகாக்கவும்.வைரஸ் பின்னர் லைசிஸ் பஃபரால் வழங்கப்படும் மிகவும் மோசமான நிலைமைகளின் கீழ் லைஸ் செய்யப்படுகிறது.

மாதிரி லைஸ் செய்யப்பட்ட பிறகு, சுத்திகரிப்பு செயல்முறைக்கு ஒரு மையவிலக்கு குழாய் பயன்படுத்தப்படுகிறது.மாதிரி மையவிலக்கு குழாயில் ஏற்றப்பட்டு பின்னர் மையவிலக்கு செய்யப்படுகிறது.

இந்த செயல்முறை ஒரு திடமான கட்ட பிரித்தெடுத்தல் முறையாகும், இதில் நிலையான கட்டம் சிலிக்கா ஜெல் மேட்ரிக்ஸைக் கொண்டுள்ளது.

உகந்த உப்பு மற்றும் pH நிலைகளின் கீழ், RNA மூலக்கூறுகள் சிலிக்கா மென்படலத்துடன் பிணைக்கப்படுகின்றன.

அதே நேரத்தில், புரதம் மற்றும் பிற அசுத்தங்கள் அகற்றப்படுகின்றன.

மையவிலக்கத்திற்குப் பிறகு, மையவிலக்குக் குழாயை ஒரு சுத்தமான சேகரிப்பு குழாயில் வைத்து, வடிகட்டியை நிராகரித்து, பின்னர் வாஷிங் பஃபரைச் சேர்க்கவும்.

சவ்வு வழியாக கழுவும் இடையகத்தை கட்டாயப்படுத்த மீண்டும் மையவிலக்கில் குழாயை வைக்கவும்.இது மென்படலத்தில் இருந்து மீதமுள்ள அனைத்து அசுத்தங்களையும் அகற்றும், சிலிக்கா ஜெல்லுடன் RNA மட்டும் பிணைக்கப்படும்.

மாதிரி கழுவப்பட்ட பிறகு, குழாயை ஒரு சுத்தமான மைக்ரோ சென்ட்ரிஃப்யூஜ் குழாயில் வைத்து, எலுஷன் பஃபரைச் சேர்க்கவும்.

பின்னர் சவ்வு வழியாக எலுஷன் பஃபரை கட்டாயப்படுத்த இது மையவிலக்கு செய்யப்படுகிறது.எலுஷன் பஃபர் ஸ்பின் நெடுவரிசையிலிருந்து வைரஸ் ஆர்என்ஏவை நீக்குகிறது மற்றும் புரதங்கள், தடுப்பான்கள் மற்றும் பிற அசுத்தங்கள் இல்லாத சுத்திகரிக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏவைப் பெறுகிறது.

படி 2

கலப்பு செறிவு

வைரஸ் ஆர்என்ஏவை பிரித்தெடுத்த பிறகு, பிசிஆர் பெருக்கத்திற்கான எதிர்வினை கலவையை தயாரிப்பது அடுத்த படியாகும்.இந்த கட்டத்தில், செறிவு பயன்படுத்தப்படுகிறது.இந்த செறிவூட்டப்பட்ட தீர்வு என்பது ஒரு ப்ரீமிக்ஸ், ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ், நியூக்ளியோடைடுகள், ஃபார்வர்ட் ப்ரைமர், ரிவர்ஸ் ப்ரைமர், டாக்மான் ப்ரோப் மற்றும் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஒரு கலவையான செறிவூட்டப்பட்ட தீர்வாகும்.

இறுதியாக, இந்த எதிர்வினை கலவையை முடிக்க, RNA டெம்ப்ளேட் சேர்க்கப்பட்டது.குழாய்கள் துடிப்பு சுழல் மூலம் கலக்கப்படுகின்றன, பின்னர் எதிர்வினை கலவை PCR தட்டில் ஏற்றப்படுகிறது.PCR தகடு பொதுவாக 96 கிணறுகளைக் கொண்டுள்ளது மற்றும் ஒரே நேரத்தில் பல மாதிரிகளை பகுப்பாய்வு செய்யலாம்.

படி 3

PCR பெருக்கம்

அடுத்து, PCR இயந்திரத்தில் தகட்டை வைக்கவும், இது அடிப்படையில் ஒரு வெப்ப சுழற்சியாகும்.

RdrRP மரபணு, E மரபணு மற்றும் N மரபணுவில் இலக்கு வரிசையைப் பெருக்கி, 2019 நாவல் கொரோனா வைரஸைக் கண்டறிய நிகழ்நேர RT-PCR பயன்படுத்தப்படுகிறது.இலக்கு மரபணுவின் தேர்வு ப்ரைமர் மற்றும் ஆய்வு வரிசையைப் பொறுத்தது.

RT-PCR இன் முதல் படி தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ஆகும்.நிரப்பு டிஎன்ஏவின் முதல் இழை ஒருங்கிணைக்கப்படுகிறது, இது பிசிஆர் ரிவர்ஸ் ப்ரைமரால் தொடங்கப்படுகிறது, இது வைரஸ் ஆர்என்ஏ மரபணுவின் நிரப்பு பகுதியுடன் பிணைக்கிறது.பின் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் டிஎன்ஏ நியூக்ளியோடைடுகளை ப்ரைமரின் 3′இறுதியில் சேர்க்கிறது, இது வைரல் ஆர்என்ஏவுடன் இணையாக டிஎன்ஏவை ஒருங்கிணைக்கிறது.இந்த படிநிலையின் வெப்பநிலை மற்றும் கால அளவு ப்ரைமர்கள், இலக்கு RNA மற்றும் பயன்படுத்தப்படும் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் ஆகியவற்றைப் பொறுத்தது.

அடுத்து, ஒரு ஆரம்ப டினாட்டரேஷன் படி பயன்படுத்தப்படுகிறது, இதன் விளைவாக ஆர்என்ஏ-டிஎன்ஏ கலப்பினத்தின் சிதைவு ஏற்படுகிறது.டிஎன்ஏ பாலிமரேஸை செயல்படுத்த இந்த படி அவசியம்.அதே நேரத்தில், தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் செயலிழக்கப்படுகிறது.

PCR தொடர்ச்சியான வெப்ப சுழற்சிகளைக் கொண்டுள்ளது.ஒவ்வொரு சுழற்சியும் டினாட்டரேஷன், அனீலிங் மற்றும் நீட்டிப்பு படிகளைக் கொண்டுள்ளது.

டினாட்டரேஷன் படியானது எதிர்வினை அறையை 95 டிகிரி செல்சியஸுக்கு சூடாக்கி, இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட்டைக் குறைக்க பயன்படுத்துகிறது.

அடுத்த கட்டத்தில், எதிர்வினை வெப்பநிலை 58 டிகிரி செல்சியஸாகக் குறைக்கப்படுகிறது, இது முன்னோக்கி ப்ரைமரை அதன் ஒற்றை இழையான டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட்டின் நிரப்பு பகுதிக்கு இணைக்க அனுமதிக்கிறது.அனீலிங் வெப்பநிலை நேரடியாக ப்ரைமரின் நீளம் மற்றும் கலவையைப் பொறுத்தது.

நீட்டிப்பு படியில், டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட் இழைக்கு துணையாக இருக்கும் புதிய டிஎன்ஏ இழையை ஒருங்கிணைக்கிறது.எதிர்வினை கலவையிலிருந்து 5′to 3′திசையில் உள்ள டெம்ப்ளேட்டிற்கு இணையான இலவச கருக்களை சேர்ப்பதன் மூலம்.இந்த படிநிலையின் வெப்பநிலை பயன்படுத்தப்படும் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸைப் பொறுத்தது.

முதல் சுழற்சிக்குப் பிறகு, இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏ இலக்கு பெறப்படுகிறது.

பின்னர், இரண்டாவது சுழற்சியை உள்ளிடவும்.இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏ இரண்டு ஒற்றை இழை டிஎன்ஏ மூலக்கூறுகளை உருவாக்குவதற்கு குறைக்கப்படுகிறது.

அடுத்த கட்டத்தில், எதிர்வினை வெப்பநிலை குறைக்கப்படுகிறது, ப்ரைமர்கள் ஒவ்வொரு ஒற்றை இழை DNA டெம்ப்ளேட்டிலும் இணைக்கப்படுகின்றன, மேலும் Taq-man ஆய்வு இலக்கு DNAவின் நிரப்பு பகுதிக்கு இணைக்கப்படுகிறது.

TaqMan ஆய்வு ஆனது ஒலிகோநியூக்ளியோடைடு ஆய்வின் 5′இறுதியுடன் இணைக்கப்பட்ட ஃப்ளோரோஃபோரைக் கொண்டுள்ளது.சைக்லரின் ஒளி மூலத்தால் உற்சாகமடையும் போது, ​​ஃப்ளோரோஃபோர் ஃப்ளோரசன்ஸை வெளியிடுகிறது.கூடுதலாக, ஆய்வு 3′இறுதியில் ஒரு தணிப்பான் கொண்டது.நிருபர் மரபணுவின் அருகாமையில் க்வென்ச்சர் ஃப்ளோரசன்ஸைக் கண்டறிவதைத் தடுக்கிறது.

நீட்டிப்பு கட்டத்தில், டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் ஒரு புதிய இழையை ஒருங்கிணைக்கிறது.பாலிமரேஸ் TaqMan ஆய்வை அடையும் போது, ​​அதன் எண்டோஜெனஸ் 5′நியூக்லீஸ் செயல்பாடு ஆய்வை பிளவுபடுத்தி, சாயத்தை தணிப்பதில் இருந்து பிரிக்கிறது.

PCR இன் ஒவ்வொரு சுழற்சியிலும், அதிக சாய மூலக்கூறுகள் வெளியிடப்படுகின்றன, இதன் விளைவாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட ஆம்பிளிகான்களின் எண்ணிக்கைக்கு விகிதாசாரமாக ஒளிரும் தீவிரம் அதிகரிக்கிறது.

இந்த முறை மாதிரியில் கொடுக்கப்பட்ட வரிசையின் எண்ணிக்கையை மதிப்பிட அனுமதிக்கிறது.ஒவ்வொரு சுழற்சியிலும் இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏ துண்டுகளின் எண்ணிக்கை இரட்டிப்பாகிறது.எனவே, மிகச் சிறிய மாதிரிகளை பகுப்பாய்வு செய்ய PCR பயன்படுத்தப்படலாம்.

ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னலை அளவிடுவதற்கு, டங்ஸ்டன் ஆலசன் விளக்கு, தூண்டுதல் வடிகட்டி, பிரதிபலிப்பான், லென்ஸ், உமிழ்வு வடிகட்டி மற்றும் சார்ஜ் இணைக்கப்பட்ட சாதனத்தைப் பயன்படுத்தும் CCD கேமரா.

படி 4 கண்டறிதல்

ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னலை அளவிடுவதற்கு, டங்ஸ்டன் ஆலசன் விளக்கு, தூண்டுதல் வடிகட்டி, பிரதிபலிப்பான், லென்ஸ், உமிழ்வு வடிகட்டி மற்றும் சார்ஜ் இணைக்கப்பட்ட சாதனத்தைப் பயன்படுத்தும் CCD கேமரா.

விளக்கிலிருந்து வடிகட்டப்பட்ட ஒளி பிரதிபலிப்பாளரால் பிரதிபலிக்கப்பட்டு, மின்தேக்கி லென்ஸ் வழியாகச் சென்று, ஒவ்வொரு துளையின் மையத்திலும் கவனம் செலுத்துகிறது.பின்னர் துளையிலிருந்து வெளிப்படும் ஒளிரும் கண்ணாடியிலிருந்து பிரதிபலிக்கிறது, உமிழ்வு வடிகட்டி வழியாகச் சென்று, CCD கேமரா மூலம் கண்டறியப்படுகிறது.ஒவ்வொரு PCR சுழற்சியிலும், சுய-உற்சாகமான ஃப்ளோரோஃபோர் ஒளியை CCD மூலம் கண்டறிய முடியும்.

இது கைப்பற்றப்பட்ட ஒளியை டிஜிட்டல் தரவுகளாக மாற்றுகிறது.இந்த முறை நிகழ்நேர PCR என்று அழைக்கப்படுகிறது, மேலும் இது PCR எதிர்வினையின் முன்னேற்றத்தை நிகழ்நேர கண்காணிப்பை அனுமதிக்கிறது.