RT-qPCR என்பது மூலக்கூறு உயிரியலின் அடிப்படை பரிசோதனையாகும், மேலும் அனைவரும் அதை நன்கு அறிந்திருக்க வேண்டும்.இது முக்கியமாக மூன்று படிகளை உள்ளடக்கியது: ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்தல், சிடிஎன்ஏவில் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் நிகழ்நேர ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR.இது உதவாது, என்ன நடக்கிறது?இதில் சிக்கல் இருக்க வாய்ப்புள்ளதுதலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் பரிசோதனை!ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் பரிசோதனைக்கு RNA, dNTP, ப்ரைமர்கள் மற்றும்தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ்மையவிலக்குக் குழாயில் நன்கு கலக்கவும், ஆனால் உண்மையான செயல்பாட்டுச் செயல்பாட்டில், கவனம் செலுத்த வேண்டிய பல விவரங்கள் இன்னும் உள்ளன.அதைப் பற்றி அறிந்து கொள்வோம்!

ஆர்என்ஏவின் தரத்தை எப்படி மதிப்பிடுவது?
சிடிஎன்ஏவைப் பெற, ஆர்என்ஏவின் தரம் முக்கியமானது!ஆர்என்ஏ தரத்தை முக்கியமாக இரண்டு அம்சங்களில் இருந்து கண்டறியலாம்:
(1) ஆர்என்ஏ ஒருமைப்பாடு:ஆர்என்ஏ ஒருமைப்பாட்டை அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் சரிபார்க்கலாம். யூகாரியோட்களை உதாரணமாக எடுத்துக் கொண்டால், முழுமையான மொத்த ஆர்என்ஏ மூன்று தெளிவான பட்டைகளைக் கொண்டுள்ளது, பெரியது முதல் சிறியது வரையிலான மூலக்கூறு எடைகள் 28S, 18S மற்றும் 5S ஆகும், மேலும் 28S 18S ஐ விட இரு மடங்கு பிரகாசமாக இருக்கும்;மூன்று பட்டைகள் காணப்பட்டால், ஆனால் பேண்ட் வகை மங்கலாக இருந்தால் அல்லது டிஃப்யூஷன் என்றால் ஆர்என்ஏ ஓரளவு சிதைந்துள்ளது என்று அர்த்தம்.இந்த நேரத்தில், தயவுசெய்து தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் எதிர்வினையை உடனடியாகச் செய்து, டெம்ப்ளேட் உள்ளீட்டை சரியான முறையில் அதிகரிக்கவும்;ஒரு சிறிய மூலக்கூறு எடை அல்லது பட்டை இல்லாத ஒரு பட்டையை மட்டும் பார்க்க முடியாவிட்டால், RNA முற்றிலும் சிதைந்துவிட்டதால், மீண்டும் பிரித்தெடுக்கப்பட வேண்டும்.அஜிலன்ட் 2100, உச்ச வரைபடம் மற்றும் RIN மதிப்புடன் RNA இன் ஒருமைப்பாட்டைக் குறிக்கிறது.நியூக்ளிக் அமிலம் அப்படியே இருந்தால், எலக்ட்ரோபெரோகிராமின் அடிப்படை தட்டையானது;நியூக்ளிக் அமிலம் கடுமையாக சிதைந்தால், அடிப்படை சீரற்றதாக இருக்கும் மற்றும் அதிக சிதைவு உச்சங்கள் தோன்றும்;RIN இன் மதிப்பு 0-10 வரம்பிற்குள் RNA இன் ஒருமைப்பாட்டை பிரதிபலிக்கிறது, பெரிய மதிப்பு, RNA இன் தரம் சிறப்பாக இருக்கும்.சரி, முழுமையின் அதிக அளவு.
(2) ஆர்என்ஏவின் தூய்மை:OD260/280 விகிதத்தை UV ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமெட்ரி மூலம் கண்டறிய முடியும்.OD260/280 இன் விகிதம் 1.9 மற்றும் 2.1 க்கு இடையில் இருந்தால், தூய்மை மிகவும் நன்றாக இருக்கும்.
எஞ்சியிருக்கும் மரபணு DNA துல்லியமற்ற அளவு முடிவுகளுக்கு வழிவகுக்கும்
ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுக்கப்படும் போது, ​​நாம் பெறும் ஆர்.என்.ஏ சுத்தம் செய்யப்படாத ஜீனோமிக் டிஎன்ஏ (ஜிடிஎன்ஏ) உடன் கலக்கப்படலாம்.எனவே, தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்குப் பிறகு சிடிஎன்ஏவும் கலக்கப்படும்gDNA.கீழ்நிலையின் போதுqPCRஎதிர்வினை,cDNAமற்றும் gDNA ஒரே நேரத்தில் பெருக்கப்படலாம், இதன் விளைவாக ஒப்பீட்டளவில் சிறிய CT மதிப்பு, அதனால் முடிவுகள் பக்கச்சார்பானதாக இருக்கலாம்.
எனவே இந்த சூழ்நிலையில் நாம் என்ன செய்ய வேண்டும்?முன்னோடிபரிந்துரைக்கிறது:
(1) RNA பிரித்தெடுக்கும் போது நெடுவரிசை பிரித்தெடுத்தல் மூலம் அகற்றப்படும், தலைகீழ் RNA மீது மரபணு சுத்தம் செய்யவும்;
(2) பிரித்தெடுக்கப்பட்ட RNA ஐ DNase உடன் சிகிச்சை செய்யவும்I , ஆனால் அதை EDTA உடன் நிறுத்தவும்;
தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் எதிர்வினைகள்மரபணு அழிக்கும் தொகுதிகளுடன்;

தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கு ப்ரைமர்களை எவ்வாறு தேர்வு செய்வது?
தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ப்ரைமர்கள் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் எதிர்வினையின் முடிவையும் பாதிக்கிறது.பரிசோதனையின் குறிப்பிட்ட சூழ்நிலைகளுக்கு ஏற்ப, ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கான சீரற்ற ப்ரைமர்கள், ஒலிகோ டிடி அல்லது மரபணு சார்ந்த ப்ரைமர்களை நீங்கள் தேர்வு செய்யலாம்:
(1) குறிப்பிட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள்: மரபணு சார்ந்த ப்ரைமர்கள் பரிந்துரைக்கப்படுகின்றன;
(2) நீண்ட துண்டு டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள்: Oligo dT/gene-specific primers பரிந்துரைக்கப்படுகிறது;
(3) நீண்ட பிரிவு டிரான்ஸ்கிரிப்ட்களின் உள் துண்டுகள்: மரபணு சார்ந்த ப்ரைமர்கள்/ ரேண்டம் ப்ரைமர்கள் / ரேண்டம் ப்ரைமர்கள் + ஒலிகோ டிடி.தொடர்ந்து qPCR சோதனை நடத்தப்பட்டால், Oligo dT ஐ தனியாகப் பயன்படுத்த முடியாது, ஏனெனில் Oligo dT ஐப் பயன்படுத்துவது 3′ இறுதிச் சார்பை ஏற்படுத்தலாம், இது துல்லியமற்ற qPCR பரிசோதனை முடிவுகளுக்கு வழிவகுக்கும்;
(4) மைஆர்என்ஏ: ஸ்டெம்-லூப் ப்ரைமர்கள் அல்லது டெயில்லிங் ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தலாம்.

ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் தயாரிப்பு சிடிஎன்ஏவை அளவிடுவதற்கு எத்தனை முறை நீர்த்த வேண்டும்?
தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் தயாரிப்பின் cDNA ஐப் பெற்ற பிறகு, qPCR சோதனைகளுக்கு cDNA எத்தனை முறை நீர்த்தப்பட வேண்டும் என்பது மிகவும் முக்கியமானது.சிடிஎன்ஏ செறிவு மிக அதிகமாகவோ அல்லது குறைவாகவோ இருந்தால், பெருக்க திறன் பாதிக்கப்படலாம்.cDNA செறிவை அளவிட முடியுமா, அதை எப்படி செய்ய வேண்டும்?
(1) தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் தயாரிப்பின் சிடிஎன்ஏ செறிவை அளவிட முடியாது, ஏனெனில் சிடிஎன்ஏ தயாரிப்பைத் தவிர, தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் தயாரிப்பில் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் எஞ்சிய பஃபர், ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ், ப்ரைமர்கள் போன்றவையும் உள்ளன, இது செறிவு அளவீட்டு முடிவுகளில் தலையிடும் மற்றும் OD/280260/280260 உண்மையான cDNA விளைச்சலை பிரதிபலிக்கிறது.இந்த நேரத்தில், சில நண்பர்கள் சொல்வார்கள், நான் சுத்திகரிக்கப்பட்ட பிறகு செறிவை அளவிடுவேன்;இங்கே, சிடிஎன்ஏ சுத்திகரிக்க பரிந்துரைக்கப்படவில்லை என்பதை ஃபோர்ஜீன் நினைவூட்ட விரும்புகிறது, ஏனெனில் தலைகீழ் மாற்றத்தால் பெறப்பட்ட சிடிஎன்ஏவின் நீளம் வேறுபட்டது, மேலும் சுத்திகரிப்பதில் குறுகிய சிடிஎன்ஏ இழக்கப்படும்.
(2) எனவே என்ன செய்வது?qPCR பரிசோதனைக்கு முன், சிடிஎன்ஏவின் நீர்த்த சாய்வை முன் பரிசோதனை மூலம் தீர்மானிக்க முடியும்.எடுத்துக்காட்டாக: cDNA ஸ்டாக் கரைசல், 10 மடங்கு நீர்த்தல் மற்றும் 100 மடங்கு நீர்த்தல் ஆகியவற்றை qPCR சோதனைகளுக்கு டெம்ப்ளேட்டுகளாகப் பயன்படுத்தவும், மேலும் 18-28 வரம்பில் உள்ள CT மதிப்பைக் கொண்ட நீர்த்த காரணியைத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.

மைஆர்என்ஏக்கள் எவ்வாறு தலைகீழ் படியெடுக்கப்பட வேண்டும்?
miRNA என்பது 22 nt அளவு கொண்ட ஒரு ஒற்றை இழை கொண்ட சிறிய மூலக்கூறு ஆர்என்ஏ ஆகும், இது புரதத்திற்கு குறியீடு இல்லை.அதன் குறுகிய நீளம் காரணமாக, வழக்கமான qPCR முறையானது அதை நேரடியாகக் கணக்கிடுவது கடினம், எனவே miRNAவை நீட்டிப்பது பெரும்பாலும் அவசியம்;miRNA க்கு பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் முறைகளில் ஸ்டெம்-லூப் முறை மற்றும் டெயில்லிங் முறை ஆகியவை அடங்கும்.
ஸ்டெம்-லூப் ப்ரைமர்களைச் சேர்ப்பதன் மூலம் மைஆர்என்ஏவை நீட்டிப்பதே ஸ்டெம்-லூப் முறை.இந்த கண்டறிதல் முறை அதிக உணர்திறன் மற்றும் தனித்தன்மையைக் கொண்டுள்ளது, ஆனால் கண்டறிதல் செயல்திறன் குறைவாக உள்ளது.ஒரு தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ஒரு miRNA மற்றும் ஒரு உள் குறிப்பை மட்டுமே கண்டறிய முடியும்;வால்-சேர்க்கும் முறை இரண்டால் ஆனது, பாலிஏ பாலிமரேஸ் மற்றும் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் ஆகிய இரண்டு என்சைம்களின் கூட்டு நடவடிக்கையால் இது நிறைவு செய்யப்படுகிறது.பாலிஏ பாலிமரேஸ் அதன் நீளத்தை அதிகரிக்க மைஆர்என்ஏவில் பாலிஏ டெயில்களைச் சேர்ப்பதற்குப் பொறுப்பாகும், மேலும் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் எதிர்வினையைச் செய்கிறது.இந்த முறை அதிக கண்டறிதல் செயல்திறன் கொண்டது மற்றும் பல மைஆர்என்ஏக்கள் மற்றும் உள் குறிப்புகளை ஒரு தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனில் கண்டறிய முடியும், ஆனால் ஸ்டெம்-லூப் முறையில் உணர்திறன் மற்றும் தனித்தன்மை குறைவாக உள்ளது.