PCR என்பது மிகவும் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படும் நியூக்ளிக் அமிலம் பெருக்க தொழில்நுட்பம் மற்றும் அதன் உணர்திறன் மற்றும் தனித்தன்மை காரணமாக பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.இருப்பினும், PCR க்கு மீண்டும் மீண்டும் வெப்பக் குறைப்பு தேவைப்படுகிறது மற்றும் கருவிகள் மற்றும் உபகரணங்களை நம்பியிருப்பதன் வரம்புகளிலிருந்து விடுபட முடியாது, இது மருத்துவ துறை சோதனையில் அதன் பயன்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்துகிறது.

1990 களின் முற்பகுதியில் இருந்து, பல ஆய்வகங்கள் நிலையான வெப்பநிலை பெருக்க தொழில்நுட்பத்தை உருவாக்கத் தொடங்கியுள்ளன, அவை வெப்பக் குறைப்பு தேவையில்லை.இப்போது அவர்கள் லூப்-மத்தியஸ்த சமவெப்ப பெருக்க தொழில்நுட்பம், இழை மாற்று சமவெப்ப பெருக்க தொழில்நுட்பம், உருட்டல் வட்ட சமவெப்ப பெருக்க தொழில்நுட்பம் மற்றும் நியூக்ளிக் அமில வரிசை சார்பு ஆகியவற்றை உருவாக்கியுள்ளனர்.சமவெப்ப பெருக்க தொழில்நுட்பம் மற்றும் பிற தொழில்நுட்பங்கள். 

Lஓப்-மத்தியஸ்த சமவெப்ப பெருக்கம்

டிஎன்ஏ சுமார் 65 டிகிரி செல்சியஸ் அளவில் ஒரு டைனமிக் சமநிலை நிலையில் உள்ளது என்பதன் அடிப்படையில் பெருக்கக் கொள்கை உள்ளது.எந்தவொரு ப்ரைமரும் அடிப்படை-ஜோடியாகி, இரட்டை இழை கொண்ட டிஎன்ஏவின் நிரப்பு பகுதிக்கு நீட்டிக்கப்பட்டால், மற்ற இழை பிரிந்து ஒற்றை இழையாக மாறும்.

இந்த வெப்பநிலையில், டிஎன்ஏ இழை-இடப்பெயர்ச்சி டிஎன்ஏ பாலிமரேஸைச் சார்ந்து 4 குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்துகிறது.

இலக்கு மரபணுவில் 6 குறிப்பிட்ட பகுதிகளான F3, F2, F1, B1, B2, B3 ஆகியவற்றை முதலில் தீர்மானிக்கவும், பின்னர் இந்த 6 குறிப்பிட்ட பகுதிகளின் அடிப்படையில் 4 ப்ரைமர்களை வடிவமைக்கவும் (கீழே உள்ள படத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது):

முன்னோக்கி உள் ப்ரைமர் (FIP) F1c மற்றும் F2 ஆகியவற்றால் ஆனது.

பின்தங்கிய உள் ப்ரைமர் (BIP) B1c மற்றும் B2 ஆகியவற்றால் ஆனது, மற்றும் TTTT நடுவில் ஸ்பேசராகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.

வெளிப்புற ப்ரைமர்கள் F3 மற்றும் B3 ஆகியவை இலக்கு மரபணுவில் முறையே F3 மற்றும் B3 பகுதிகளால் ஆனவை.

LAMP எதிர்வினை அமைப்பில், உள் ப்ரைமரின் செறிவு வெளிப்புற ப்ரைமரை விட பல மடங்கு அதிகமாகும்.டிஎன்ஏ இரட்டை இழையை உருவாக்க ஒரு நிரப்பு இழையை ஒருங்கிணைக்க உள் ப்ரைமர் முதலில் டெம்ப்ளேட் இழையுடன் இணைக்கப்படுகிறது.பின்னர், வெளிப்புற ப்ரைமர் டெம்ப்ளேட் இழையுடன் இணைந்து டிஎன்ஏ இரட்டை இழையை உருவாக்குகிறது.BstDNA பாலிமரேஸின் செயல்பாட்டின் கீழ், உள் ப்ரைமரால் ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட நிரப்பு இழை வெளியிடப்படுகிறது.தொடர்ச்சியான எதிர்வினைகளுக்குப் பிறகு, நிரப்பு இழை இறுதியாக ஒரு டம்பெல் அமைப்புடன் ஒரு டிஎன்ஏ இழையை உருவாக்குகிறது.

டம்ப்பெல் அமைப்பு டிஎன்ஏ சிங்கிள் ஸ்ட்ராண்ட் ஒரு டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, இது தொடர்ந்து டிஎன்ஏவை ஒரு திறந்த முனையுடன் ஒரு இடைநிலை ஸ்டெம்-லூப் கட்டமைப்பை உருவாக்குகிறது.உள் மற்றும் வெளிப்புற ப்ரைமர்கள் இடைநிலை ஸ்டெம்-லூப் அமைப்பு டிஎன்ஏவை தொடர்ந்து ஸ்ட்ராண்ட் இடப்பெயர்ச்சி மற்றும் நீட்டிப்பு எதிர்வினைகளுக்கு உட்படுத்துவதற்கு வழிகாட்டுகிறது, மேலும் இறுதியாக பல ஸ்டெம்-லூப் கட்டமைப்புகளை வெவ்வேறு நீளங்களுடன் உருவாக்குகிறது.டிஎன்ஏ கலவை.

லூப்-மத்தியஸ்த சமவெப்ப பெருக்கத்தின் நன்மைகள் மற்றும் தீமைகள்

LAMP இன் நன்மைகள்:

(1) உயர் பெருக்க செயல்திறன், இது இலக்கு மரபணுவின் 1-10 நகல்களை 1 மணிநேரத்திற்குள் திறம்பட பெருக்க முடியும், மேலும் பெருக்க செயல்திறன் சாதாரண PCR ஐ விட 10-100 மடங்கு ஆகும்.

(2) எதிர்வினை நேரம் குறுகியது, தனித்தன்மை வலுவானது மற்றும் சிறப்பு உபகரணங்கள் தேவையில்லை.

LAMP இன் குறைபாடுகள்:

(1) ப்ரைமர்களுக்கான தேவைகள் குறிப்பாக அதிகம்.

(2) பெருக்கப்பட்ட தயாரிப்பை குளோனிங் மற்றும் வரிசைப்படுத்துவதற்குப் பயன்படுத்த முடியாது, ஆனால் தீர்ப்புக்கு மட்டுமே பயன்படுத்த முடியும்.

(3) அதன் வலுவான உணர்திறன் காரணமாக, ஏரோசோல்களை உருவாக்குவது எளிது, இது தவறான நேர்மறைகளை ஏற்படுத்துகிறது மற்றும் சோதனை முடிவுகளை பாதிக்கிறது.

Sடிராண்ட் இடப்பெயர்ச்சி பெருக்கம்

ஸ்ட்ராண்ட் டிஸ்ப்ளேஸ்மென்ட் ஆம்ப்ளிஃபிகேஷன் (எஸ்டிஏ) என்பது 1992 இல் அமெரிக்க அறிஞர் வாக்கர் முதன்முதலில் முன்மொழியப்பட்ட நொதி எதிர்வினையின் அடிப்படையிலான இன் விட்ரோ ஐசோதெர்மல் டிஎன்ஏ பெருக்க நுட்பமாகும்.

SDA இன் அடிப்படை அமைப்பில் ஒரு கட்டுப்பாடு எண்டோநியூக்லீஸ், ஸ்ட்ராண்ட் டிஸ்ப்ளேஸ்மென்ட் செயல்பாடு கொண்ட டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ், இரண்டு ஜோடி ப்ரைமர்கள், டிஎன்டிபிகள் மற்றும் கால்சியம் மற்றும் மெக்னீசியம் அயனிகள் மற்றும் பஃபர் சிஸ்டம் ஆகியவை அடங்கும்.

இழை இடப்பெயர்ச்சி பெருக்கத்தின் கொள்கையானது இலக்கு டிஎன்ஏவின் இரு முனைகளிலும் உள்ள வேதியியல் மாற்றியமைக்கப்பட்ட கட்டுப்பாடு எண்டோநியூக்லீஸ் அங்கீகார வரிசையை அடிப்படையாகக் கொண்டது.எண்டோநியூக்லீஸ் இழை டிஎன்ஏவில் உள்ள இடைவெளியை அதன் அங்கீகார தளத்தில் திறக்கிறது, மேலும் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் இடைவெளி 3′ முடிவை நீட்டி அடுத்த டிஎன்ஏ இழையை மாற்றுகிறது.

டிஎன்ஏவின் மாற்றப்பட்ட ஒற்றை இழைகளை ப்ரைமர்களுடன் இணைக்கலாம் மற்றும் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் மூலம் இரட்டை இழைகளாக நீட்டிக்க முடியும்.இந்த செயல்முறை தொடர்ச்சியாக மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்படுகிறது, இதனால் இலக்கு வரிசை திறமையாக பெருக்கப்படுகிறது.

இழை இடப்பெயர்ச்சி பெருக்க தொழில்நுட்பத்தின் நன்மைகள் மற்றும் தீமைகள்

SDA இன் நன்மைகள்:

பெருக்க செயல்திறன் அதிகமாக உள்ளது, எதிர்வினை நேரம் குறைவாக உள்ளது, தனித்தன்மை வலுவாக உள்ளது, மேலும் சிறப்பு உபகரணங்கள் தேவையில்லை.

SDA இன் குறைபாடுகள்:

தயாரிப்புகள் சீரானவை அல்ல, மேலும் சில ஒற்றை இழை மற்றும் இரட்டை இழை தயாரிப்புகள் எப்பொழுதும் SDA சுழற்சியில் உற்பத்தி செய்யப்படுகின்றன, மேலும் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் கண்டறியப்படும் போது டெய்லிங் தவிர்க்க முடியாமல் ஏற்படும்.

Rolling வட்டம் பெருக்கம்

ரோலிங் வட்டம் பெருக்கம் (ஆர்சிஏ) ரோலிங் வட்டம் மூலம் நோய்க்கிருமி உயிரினங்களிலிருந்து டிஎன்ஏவை நகலெடுக்கும் முறையை வரைவதன் மூலம் முன்மொழியப்பட்டது.இது ஒரு நிலையான வெப்பநிலையில் ஒரு டெம்ப்ளேட்டாக ஒற்றை இழை கொண்ட வட்ட டிஎன்ஏவைப் பயன்படுத்துவதைக் குறிக்கிறது, மேலும் ஒரு சிறப்பு டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் (Phi29 போன்றவை) ) இலக்கு மரபணுவின் பெருக்கத்தை அடைய உருட்டல் வட்டம் டிஎன்ஏ தொகுப்பின் செயல்பாட்டின் கீழ்.

RCA ஐ நேரியல் பெருக்கம் மற்றும் அதிவேக பெருக்கம் என பிரிக்கலாம்.நேரியல் RCA இன் செயல்திறன் 10 ஐ அடையலாம்⁵நேரங்கள், மற்றும் அதிவேக RCA இன் செயல்திறன் 10 ஐ அடையலாம்⁹முறை.

எளிய வேறுபாடு, கீழே உள்ள படத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, நேரியல் பெருக்கம் 1 ப்ரைமரை மட்டுமே பயன்படுத்துகிறது, அதிவேக பெருக்கம் b 2 ப்ரைமர்களைக் கொண்டுள்ளது.

லீனியர் ஆர்சிஏ சிங்கிள் ப்ரைமர் ஆர்சிஏ என்றும் அழைக்கப்படுகிறது.ஒரு ப்ரைமர் வட்ட டிஎன்ஏவுடன் பிணைக்கிறது மற்றும் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் செயல்பாட்டால் நீட்டிக்கப்படுகிறது.தயாரிப்பு என்பது ஒரு லூப்பின் நீளத்தை விட ஆயிரக்கணக்கான மடங்கு அதிக எண்ணிக்கையிலான தொடர்ச்சியான தொடர்களைக் கொண்ட ஒரு நேரியல் ஒற்றை இழையாகும்.

நேரியல் RCA இன் தயாரிப்பு எப்போதும் தொடக்க ப்ரைமருடன் இணைக்கப்பட்டிருப்பதால், சிக்னலை எளிதாக சரிசெய்வது ஒரு முக்கிய நன்மையாகும்.

அதிவேக ஆர்சிஏ, ஹைப்பர் ப்ராஞ்சட் ஆம்ப்ளிஃபிகேஷன் எச்ஆர்சிஏ (ஹைப்பர் பிராஞ்சட் ஆர்சிஏ) என்றும் அழைக்கப்படுகிறது, அதிவேக ஆர்சிஏவில், ஒரு ப்ரைமர் ஆர்சிஏ தயாரிப்பைப் பெருக்குகிறது, இரண்டாவது ப்ரைமர் ஆர்சிஏ தயாரிப்புடன் கலப்பினமாக்கப்பட்டு நீட்டிக்கப்படுகிறது, மேலும் மாற்றீடு ஏற்கனவே ஆர்சிஏ தயாரிப்புடன் பிணைக்கப்பட்டுள்ளது.

உருட்டல் வட்டம் நியூக்ளிக் அமிலம் பெருக்கத்தின் நன்மைகள் மற்றும் தீமைகள்

RCA இன் நன்மைகள்:

அதிக உணர்திறன், நல்ல விவரக்குறிப்பு மற்றும் எளிதான செயல்பாடு.

RCA இன் குறைபாடுகள்:

சிக்னல் கண்டறிதலின் போது பின்னணி சிக்கல்கள்.ஆர்சிஏ வினையின் போது, ​​புழக்கத்தில் இல்லாத பேட்லாக் ஆய்வு மற்றும் வரம்பற்ற ஆய்வின் டெம்ப்ளேட் டிஎன்ஏ அல்லது ஆர்என்ஏ ஆகியவை சில பின்னணி சமிக்ஞைகளை உருவாக்கலாம். 

Nயூக்ளிகாசிட் வரிசை அடிப்படையிலான பெருக்கம்

நியூக்ளிக் அமில வரிசை அடிப்படையிலான பெருக்கம் (NASBA) என்பது PCR இன் அடிப்படையில் உருவாக்கப்பட்ட ஒரு புதிய தொழில்நுட்பமாகும்.இது ஒரு தொடர்ச்சியான மற்றும் சமவெப்ப நியூக்ளிக் அமிலம் பெருக்கமாகும், இது T7 ஊக்குவிப்பாளர் வரிசையுடன் ஒரு ஜோடி ப்ரைமர்களால் வழிநடத்தப்படுகிறது.இந்த தொழில்நுட்பமானது 2 மணி நேரத்தில் RNA டெம்ப்ளேட்டை 109 மடங்கு பெருக்க முடியும், இது வழக்கமான PCR முறையை விட 1000 மடங்கு அதிகம் மற்றும் சிறப்பு உபகரணங்கள் தேவையில்லை.

இந்த தொழில்நுட்பம் நோய் தோன்றிய உடனேயே விரைவாக கண்டறிய பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் பல நிறுவனங்கள் தற்போது இந்த முறையை ஆர்என்ஏ கண்டறிதல் கருவிகளில் பயன்படுத்துகின்றன.

ஆர்என்ஏ பெருக்கமானது ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் பிசிஆர் தொழில்நுட்பத்தையும் பயன்படுத்த முடியும் என்றாலும், நாஸ்பா அதன் சொந்த நன்மைகளைக் கொண்டுள்ளது: இது ஒப்பீட்டளவில் நிலையான வெப்பநிலை நிலைகளின் கீழ் மேற்கொள்ளப்படலாம், மேலும் இது பாரம்பரிய பிசிஆர் தொழில்நுட்பத்தை விட நிலையானது மற்றும் துல்லியமானது.

எதிர்வினை 41 டிகிரி செல்சியஸில் உள்ளது மற்றும் AMV (ஏவியன் மைலோபிளாஸ்டோசிஸ் வைரஸ்) ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ், RNase H, T7 RNA பாலிமரேஸ் மற்றும் ஒரு ஜோடி ப்ரைமர்கள் தேவை.

செயல்முறை முக்கியமாக அடங்கும்:

முன்னோக்கி ப்ரைமரில் T7 ஊக்குவிப்பாளரின் நிரப்பு வரிசை உள்ளது.எதிர்வினையின் போது, ​​முன்னோக்கி ப்ரைமர் ஆர்என்ஏ இழையுடன் பிணைக்கப்பட்டு, டிஎன்ஏ-ஆர்என்ஏ இரட்டை இழையை உருவாக்க ஏஎம்வி நொதியால் வினையூக்கப்படுகிறது.

RNase H ஆனது கலப்பின இரட்டை இழையில் உள்ள ஆர்என்ஏவை ஜீரணித்து ஒற்றை இழை DNAவைத் தக்கவைக்கிறது.

தலைகீழ் ப்ரைமர் மற்றும் AMV நொதியின் செயல்பாட்டின் கீழ், T7 ஊக்குவிப்பாளர் வரிசையைக் கொண்ட DNA இரட்டை இழை உருவாகிறது.

T7 RNA பாலிமரேஸின் செயல்பாட்டின் கீழ், டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்முறை முடிந்தது மற்றும் அதிக அளவு இலக்கு RNA உற்பத்தி செய்யப்படுகிறது.

NASBA இன் நன்மைகள்:

(1) இதன் ப்ரைமரில் T7 ப்ரோமோட்டர் வரிசை உள்ளது, ஆனால் வெளிநாட்டு இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏ T7 ஊக்குவிப்பாளர் வரிசையை கொண்டிருக்கவில்லை மற்றும் பெருக்க முடியாது, எனவே இந்த தொழில்நுட்பம் அதிக தனித்தன்மை மற்றும் உணர்திறன் கொண்டது.

(2) NASBA நேரடியாக தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்முறையை பெருக்க வினையில் இணைத்து, எதிர்வினை நேரத்தைக் குறைக்கிறது.

NASBA இன் தீமைகள்:

(1) எதிர்வினை கூறுகள் மிகவும் சிக்கலானவை.

(2) வினையின் விலையை அதிகரிக்க மூன்று வகையான நொதிகள் தேவைப்படுகின்றன.