• முகநூல்
  • இணைக்கப்பட்ட
  • வலைஒளி

Ct மதிப்பு என்பது ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR இன் மிக முக்கியமான முடிவு விளக்க வடிவமாகும்.இது மரபணு வெளிப்பாடு வேறுபாடுகள் அல்லது மரபணு நகல் எண்ணைக் கணக்கிடப் பயன்படுகிறது.எனவே ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவீட்டின் Ct மதிப்பு என்ன நியாயமானதாகக் கருதப்படுகிறது?Ct மதிப்பின் பயனுள்ள வரம்பை எவ்வாறு உறுதி செய்வது?

Ct மதிப்பு என்றால் என்ன?
qPCR பெருக்கச் செயல்பாட்டின் போது, ​​பெருக்கப்பட்ட உற்பத்தியின் ஒளிரும் சமிக்ஞை செட் ஃப்ளோரசன்ஸ் வரம்பை அடையும் போது தொடர்புடைய பெருக்க சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை (சுழற்சி த்ரெஷோல்ட்).C என்பது சைக்கிள் மற்றும் T என்பது த்ரெஷோல்ட்.எளிமையாகச் சொன்னால், Ct மதிப்பு என்பது qPCR இல் ஆரம்ப டெம்ப்ளேட் பெருக்கம் ஒரு குறிப்பிட்ட அளவு உற்பத்தியை அடையும் போது தொடர்புடைய சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையாகும்."ஒரு குறிப்பிட்ட அளவு தயாரிப்பு" என்று அழைக்கப்படுவது பின்னர் மேலும் விளக்கப்படும்.

Ct மதிப்பு என்ன செய்கிறது?

1.அதிவேக பெருக்கம், டெம்ப்ளேட் அளவு மற்றும் Ct மதிப்பு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான உறவு
வெறுமனே, qPCR இல் உள்ள மரபணுக்கள் குறிப்பிட்ட எண்ணிக்கையிலான சுழற்சிகளுக்குப் பிறகு அதிவேக பெருக்கத்தால் குவிக்கப்படுகின்றன.பெருக்க சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை மற்றும் தயாரிப்புகளின் அளவு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான உறவு: பெருக்கப்பட்ட தயாரிப்பு அளவு = ஆரம்ப டெம்ப்ளேட் தொகை × (1+En) சுழற்சிகள் எண்.இருப்பினும், qPCR எதிர்வினை எப்போதும் ஒரு சிறந்த சூழ்நிலையில் இருக்காது.பெருக்கப்பட்ட உற்பத்தியின் அளவு ஒரு "குறிப்பிட்ட தயாரிப்பு அளவு" அடையும் போது, ​​இந்த நேரத்தில் சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை Ct மதிப்பாகும், மேலும் இது அதிவேக பெருக்கக் காலத்தில் உள்ளது.Ct மதிப்புக்கும் தொடக்க டெம்ப்ளேட்டின் அளவுக்கும் இடையே உள்ள தொடர்பு: டெம்ப்ளேட்டின் Ct மதிப்புக்கும் டெம்ப்ளேட்டின் தொடக்க நகல் எண்ணின் மடக்கைக்கும் இடையே நேரியல் உறவு உள்ளது.அதிக ஆரம்ப டெம்ப்ளேட் செறிவு, சிறிய Ct மதிப்பு;ஆரம்ப டெம்ப்ளேட் செறிவு குறைவாக இருந்தால், பெரிய Ct மதிப்பு.

2. பெருக்க வளைவு, ஃப்ளோரசன்ஸ் த்ரெஷோல்ட் மற்றும் குறிப்பிட்ட PCR தயாரிப்பு அளவு
qPCR பெருக்க உற்பத்தியின் அளவு நேரடியாக ஒளிரும் சமிக்ஞையின் வடிவத்தில் வழங்கப்படுகிறது, அதாவது பெருக்க வளைவு.PCR இன் ஆரம்ப கட்டத்தில், பெருக்கம் சிறந்த நிலைமைகளின் கீழ் உள்ளது, சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை சிறியது, தயாரிப்பு குவிப்பு சிறியது, மற்றும் ஒளிரும் நிலை பின்னணியில் இருந்து தெளிவாக வேறுபடுத்த முடியாது.அதன் பிறகு, ஃப்ளோரசன்ஸ் அதிகரிக்கிறது மற்றும் அதிவேக கட்டத்தில் நுழைகிறது.PCR வினையானது அதிவேக கட்டத்தில் இருக்கும் போது ஒரு குறிப்பிட்ட கட்டத்தில் PCR தயாரிப்பின் அளவைக் கண்டறிய முடியும், இது "ஒரு குறிப்பிட்ட அளவு தயாரிப்பு" ஆகப் பயன்படுத்தப்படலாம், மேலும் டெம்ப்ளேட்டின் ஆரம்ப உள்ளடக்கத்தை இதிலிருந்து கழிக்க முடியும்.எனவே, ஒரு குறிப்பிட்ட அளவு தயாரிப்புடன் தொடர்புடைய ஒளிரும் சமிக்ஞை தீவிரம் ஃப்ளோரசன்ஸ் வாசலாகும்.

4

PCR இன் பிற்பகுதியில், பெருக்க வளைவு இனி அதிவேக பெருக்கத்தைக் காட்டாது, மேலும் நேரியல் கட்டம் மற்றும் பீடபூமி கட்டத்தில் நுழைகிறது.

3.Ct மதிப்புகளின் மறுஉருவாக்கம்
PCR சுழற்சி Ct மதிப்பின் சுழற்சி எண்ணை அடையும் போது, ​​அது உண்மையான அதிவேக பெருக்கக் காலகட்டத்திற்குள் நுழைந்துள்ளது.இந்த நேரத்தில், சிறிய பிழை பெருக்கப்படவில்லை, எனவே Ct மதிப்பின் மறுஉருவாக்கம் சிறந்தது, அதாவது, ஒரே மாதிரியானது வெவ்வேறு நேரங்களில் அல்லது வெவ்வேறு குழாய்களில் ஒரே நேரத்தில் பெருக்கப்படுகிறது.பெருக்கம், பெறப்பட்ட Ct மதிப்பு நிலையானது.

5

1. பெருக்க திறன் En
PCR பெருக்க திறன் என்பது பாலிமரேஸ் மரபணுவை ஒரு ஆம்ப்ளிகானாக மாற்றும் திறனைக் குறிக்கிறது.ஒரு டிஎன்ஏ மூலக்கூறு இரண்டு டிஎன்ஏ மூலக்கூறுகளாக மாற்றப்படும் போது பெருக்க திறன் 100% ஆகும்.பெருக்க செயல்திறன் பொதுவாக En என வெளிப்படுத்தப்படுகிறது.அடுத்தடுத்த கட்டுரைகளின் பகுப்பாய்வை எளிதாக்கும் வகையில், பெருக்க செயல்திறனைப் பாதிக்கும் காரணிகள் சுருக்கமாக அறிமுகப்படுத்தப்பட்டுள்ளன.

செல்வாக்கு செலுத்தும் காரணிகள் விளக்கம் எப்படி தீர்ப்பளிப்பது?
A. PCR தடுப்பான்கள் 1. டிஎன்ஏ வார்ப்புருவில் புரதங்கள் அல்லது சவர்க்காரம் போன்ற PCR எதிர்வினையைத் தடுக்கும் பொருட்கள் உள்ளன.2. தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்குப் பிறகு சிடிஎன்ஏ அதிக செறிவு டெம்ப்ளேட் ஆர்என்ஏ அல்லது ஆர்டி ரியாஜென்ட் கூறுகளைக் கொண்டுள்ளது, இது அடுத்தடுத்த பிசிஆர் எதிர்வினையையும் தடுக்கலாம். 1. மாசு உள்ளதா என்பதை A260/A280 மற்றும் A260/A230 அல்லது RNA எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் ஆகியவற்றின் விகிதத்தை அளவிடுவதன் மூலம் தீர்மானிக்க முடியும்.2. தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்குப் பிறகு சிடிஎன்ஏ ஒரு குறிப்பிட்ட விகிதத்தின்படி நீர்த்தப்படுகிறதா.
பி. முறையற்ற ப்ரைமர் வடிவமைப்பு ப்ரைமர்கள் திறமையாக அனீல் செய்யாது ப்ரைமர்-டைமர்கள் அல்லது ஹேர்பின்கள், பொருத்தமின்மைகள் மற்றும் சில சமயங்களில் ஸ்பான்னிங் இன்ட்ரானிக் டிசைன்கள் உள்ளதா எனப் பார்க்கவும்.
C. முறையற்ற PCR எதிர்வினை நிரல் வடிவமைப்பு 1. ப்ரைமர்கள் திறம்பட அனீல் செய்ய முடியாது2. டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் போதிய வெளியீடு இல்லை

3. நீண்ட கால உயர் வெப்பநிலை டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் செயல்பாடு குறைந்தது

1. அனீலிங் வெப்பநிலை ப்ரைமரின் டிஎம் மதிப்பை விட அதிகமாக உள்ளது2. ப்ரீ டினாட்டரேஷன் நேரம் மிகக் குறைவு

3. எதிர்வினை செயல்முறையின் ஒவ்வொரு கட்டத்தின் நேரமும் மிக நீண்டது

டி. ரியாஜெண்டுகளின் போதுமான கலவை அல்லது குழாய் பிழைகள் எதிர்வினை அமைப்பில், PCR எதிர்வினை கூறுகளின் உள்ளூர் செறிவு மிக அதிகமாகவோ அல்லது சீரற்றதாகவோ உள்ளது, இதன் விளைவாக PCR பெருக்கத்தின் அதிவேக அல்லாத பெருக்கம் ஏற்படுகிறது.  
E. ஆம்ப்ளிகான் நீளம் ஆம்ப்ளிகானின் நீளம் மிக நீளமானது, 300bp ஐ விட அதிகமாக உள்ளது, மேலும் பெருக்க திறன் குறைவாக உள்ளது ஆம்ப்ளிகான் நீளம் 80-300bp இடையே உள்ளதா எனச் சரிபார்க்கவும்
F. qPCR வினைகளின் தாக்கம் மறுபொருளில் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் செறிவு குறைவாக உள்ளது அல்லது பஃபரில் உள்ள அயனிகளின் செறிவு உகந்ததாக இல்லை, இதன் விளைவாக டாக் என்சைம் செயல்பாடு அதிகபட்சத்தை எட்டவில்லை நிலையான வளைவு மூலம் பெருக்க செயல்திறனை தீர்மானித்தல்

2.Ct மதிப்புகளின் வரம்பு
Ct மதிப்புகள் 15-35 வரை இருக்கும்.Ct மதிப்பு 15 க்கும் குறைவாக இருந்தால், பெருக்கம் அடிப்படைக் காலத்தின் வரம்பிற்குள் இருப்பதாகவும், ஃப்ளோரசன்ஸ் வரம்பை எட்டவில்லை என்றும் கருதப்படுகிறது.வெறுமனே, Ct மதிப்புக்கும் டெம்ப்ளேட்டின் ஆரம்ப நகல் எண்ணின் மடக்கைக்கும் இடையே ஒரு நேரியல் உறவு உள்ளது, அதாவது நிலையான வளைவு.நிலையான வளைவு மூலம், பெருக்க செயல்திறன் 100% ஆக இருக்கும் போது, ​​மரபணுவின் ஒற்றை நகல் எண்ணை அளவிடுவதற்கான கணக்கிடப்பட்ட Ct மதிப்பு சுமார் 35 ஆகும். இது 35 ஐ விட அதிகமாக இருந்தால், வார்ப்புருவின் ஆரம்ப நகல் எண் கோட்பாட்டளவில் 1 ஐ விட குறைவாக இருக்கும், இது அர்த்தமற்றதாக கருதப்படுகிறது.

6

வெவ்வேறு மரபணு Ct வரம்புகளுக்கு, மரபணு நகல் எண் மற்றும் ஆரம்ப டெம்ப்ளேட் தொகையில் உள்ள பெருக்க திறன் ஆகியவற்றில் உள்ள வேறுபாடு காரணமாக, மரபணுவிற்கான நிலையான வளைவை உருவாக்கி, மரபணுவின் நேரியல் கண்டறிதல் வரம்பைக் கணக்கிடுவது அவசியம்.

3.Ct மதிப்பின் செல்வாக்கு காரணிகள்
பெருக்க சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை மற்றும் தயாரிப்பின் அளவு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான உறவிலிருந்து: பெருக்கப்பட்ட பொருளின் அளவு = ஆரம்ப டெம்ப்ளேட்டின் அளவு × (1+En) சுழற்சி எண்ணின் அளவு, சிறந்த நிலைமைகளின் கீழ், ஆரம்ப டெம்ப்ளேட் மற்றும் En அளவு Ct மதிப்பில் எதிர்மறையான தாக்கத்தை ஏற்படுத்தும் என்பதைக் காணலாம்.டெம்ப்ளேட் தரம் அல்லது பெருக்க செயல்திறனில் உள்ள வேறுபாடு Ct மதிப்பை மிகப் பெரியதாகவோ அல்லது மிகச் சிறியதாகவோ ஏற்படுத்தும்.

4.Ct மதிப்பு மிகப் பெரியது அல்லது மிகச் சிறியது

7


இடுகை நேரம்: பிப்ரவரி-22-2023