மூலக்கூறு நோயறிதல் தொழில்நுட்பமானது, மனித உடலின் மரபணுப் பொருள் மற்றும் பல்வேறு நோய்க்கிருமிகளின் வெளிப்பாடு மற்றும் கட்டமைப்பைக் கண்டறிய மூலக்கூறு உயிரியல் முறைகளைப் பயன்படுத்துகிறது, இதனால் நோய்களை முன்னறிவிக்கும் மற்றும் கண்டறியும் நோக்கத்தை அடைகிறது.

சமீபத்திய ஆண்டுகளில், மூலக்கூறு கண்டறியும் தொழில்நுட்பத்தின் மேம்படுத்தல் மற்றும் மறு செய்கையுடன், மூலக்கூறு கண்டறிதலின் மருத்துவ பயன்பாடு மேலும் மேலும் விரிவானதாகவும் ஆழமாகவும் மாறியுள்ளது, மேலும் மூலக்கூறு கண்டறிதல் சந்தை விரைவான வளர்ச்சியின் காலகட்டத்தில் நுழைந்துள்ளது.

சந்தையில் உள்ள பொதுவான மூலக்கூறு கண்டறியும் தொழில்நுட்பங்களை ஆசிரியர் சுருக்கி, மூன்று பகுதிகளாகப் பிரிக்கிறார்: முதல் பகுதி PCR தொழில்நுட்பத்தை அறிமுகப்படுத்துகிறது, இரண்டாவது பகுதி நியூக்ளிக் அமில சமவெப்ப பெருக்க தொழில்நுட்பத்தை அறிமுகப்படுத்துகிறது, இரண்டாவது பகுதி வரிசைமுறை தொழில்நுட்பத்தை அறிமுகப்படுத்துகிறது.

01

பகுதி I: PCR தொழில்நுட்பம்

PCR தொழில்நுட்பம்

PCR (பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினை) என்பது 30 ஆண்டுகளுக்கும் மேலான வரலாற்றைக் கொண்ட இன் விட்ரோ டிஎன்ஏ பெருக்க தொழில்நுட்பங்களில் ஒன்றாகும்.

PCR தொழில்நுட்பம் 1983 ஆம் ஆண்டில் அமெரிக்காவின் Cetus இன் கேரி முல்லிஸால் முன்னோடியாக இருந்தது.முல்லிஸ் 1985 இல் PCR காப்புரிமைக்கு விண்ணப்பித்தார் மற்றும் அதே ஆண்டில் அறிவியல் பற்றிய முதல் PCR கல்விக் கட்டுரையை வெளியிட்டார்.முல்லிஸ் 1993 இல் வேதியியலுக்கான நோபல் பரிசை வென்றார்.

PCR இன் அடிப்படைக் கோட்பாடுகள்

PCR இலக்கு டிஎன்ஏ துண்டுகளை ஒரு மில்லியனுக்கும் அதிகமான மடங்கு அதிகரிக்க முடியும்.கொள்கை என்னவென்றால், டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் வினையூக்கத்தின் கீழ், பெற்றோர் இழை DNA ஒரு டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் ஒரு குறிப்பிட்ட ப்ரைமர் நீட்டிப்புக்கான தொடக்கப் புள்ளியாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.இது denaturation, annealing, and extension போன்ற படிகள் மூலம் விட்ரோவில் நகலெடுக்கப்படுகிறது.மகள் ஸ்ட்ராண்ட் டிஎன்ஏவின் செயல்முறை பெற்றோர் இழை டெம்ப்ளேட் டிஎன்ஏ உடன் நிரப்புகிறது.

நிலையான PCR செயல்முறை மூன்று படிகளாக பிரிக்கப்பட்டுள்ளது:

1. Denaturation: DNA இரட்டை இழைகளைப் பிரிக்க அதிக வெப்பநிலையைப் பயன்படுத்தவும்.டிஎன்ஏ இரட்டை இழைகளுக்கு இடையே உள்ள ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகள் அதிக வெப்பநிலையில் (93-98 டிகிரி செல்சியஸ்) உடைக்கப்படுகின்றன.

2. அனீலிங்: இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏ பிரிக்கப்பட்ட பிறகு, வெப்பநிலை குறைக்கப்படுகிறது, இதனால் ப்ரைமர் ஒற்றை இழை டிஎன்ஏவுடன் பிணைக்கப்படும்.

3. நீட்டிப்பு: டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ், வெப்பநிலை குறைக்கப்படும் போது பிணைக்கப்பட்ட ப்ரைமர்களில் இருந்து டிஎன்ஏ இழைகளுடன் நிரப்பு இழைகளை ஒருங்கிணைக்கத் தொடங்குகிறது.நீட்டிப்பு முடிந்ததும், ஒரு சுழற்சி நிறைவடைகிறது, மேலும் டிஎன்ஏ துண்டுகளின் எண்ணிக்கை இரட்டிப்பாகும்.

இந்த மூன்று படிகளை 25-35 முறை திருப்பிச் செலுத்தினால், டிஎன்ஏ துண்டுகளின் எண்ணிக்கை அதிவேகமாக அதிகரிக்கும்.

PCR இன் புத்திசாலித்தனம் என்னவென்றால், வெவ்வேறு இலக்கு மரபணுக்களுக்காக வெவ்வேறு ப்ரைமர்களை வடிவமைக்க முடியும், இதனால் இலக்கு மரபணு துண்டுகளை குறுகிய காலத்தில் பெருக்க முடியும்.

இதுவரை, PCR ஐ சாதாரண PCR, fluorescent quantitative PCR மற்றும் டிஜிட்டல் PCR என மூன்று வகைகளாகப் பிரிக்கலாம்.

சாதாரண PCR இன் முதல் தலைமுறை

இலக்கு மரபணுவைப் பெருக்க ஒரு சாதாரண PCR பெருக்க கருவியைப் பயன்படுத்தவும், பின்னர் தயாரிப்பைக் கண்டறிய அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸைப் பயன்படுத்தவும், தரமான பகுப்பாய்வு மட்டுமே செய்ய முடியும்.

முதல் தலைமுறை PCR இன் முக்கிய தீமைகள்:

-குறிப்பிடாத பெருக்கம் மற்றும் தவறான நேர்மறை முடிவுகளுக்கு வாய்ப்புள்ளது.

- கண்டறிதல் நீண்ட நேரம் எடுக்கும் மற்றும் அறுவை சிகிச்சை சிக்கலானது.

- தரமான சோதனை மட்டுமே செய்ய முடியும்.

இரண்டாம் தலைமுறை ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவு PCR

ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவு PCR (நிகழ்நேர PCR), qPCR என்றும் அழைக்கப்படுகிறது, இது ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னல்களின் திரட்சியின் மூலம் பெருக்கப்பட்ட தயாரிப்புகளின் திரட்சியைக் கண்காணிக்கப் பயன்படுகிறது, இது எதிர்வினை அமைப்பின் முன்னேற்றத்தைக் குறிக்கும்.

qPCR தொழில்நுட்பம் ஒரு மூடிய அமைப்பில் மேற்கொள்ளப்படுவதால், மாசுபடுவதற்கான நிகழ்தகவு குறைகிறது, மேலும் ஃப்ளோரசன் சிக்னலை அளவு கண்டறிதலுக்காக கண்காணிக்க முடியும், எனவே இது மருத்துவ நடைமுறையில் மிகவும் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது மற்றும் PCR இல் ஆதிக்கம் செலுத்தும் தொழில்நுட்பமாக மாறியுள்ளது.

நிகழ்நேர ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR இல் பயன்படுத்தப்படும் ஃப்ளோரசன்ட் பொருட்களைப் பிரிக்கலாம்: TaqMan ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வுகள், மூலக்கூறு பீக்கான்கள் மற்றும் ஃப்ளோரசன்ட் சாயங்கள்.

1) TaqMan ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வு:

PCR பெருக்கத்தின் போது, ​​ஒரு ஜோடி ப்ரைமர்களைச் சேர்க்கும்போது ஒரு குறிப்பிட்ட ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வு சேர்க்கப்படுகிறது.ஆய்வு ஒரு ஒலிகோநியூக்ளியோடைடு ஆகும், மேலும் இரண்டு முனைகளும் முறையே ஒரு நிருபர் ஃப்ளோரசன்ட் குழு மற்றும் ஒரு க்வென்சர் ஃப்ளோரசன்ட் குழுவுடன் பெயரிடப்பட்டுள்ளன.

ஆய்வு அப்படியே இருக்கும் போது, ​​நிருபர் குழுவால் வெளியிடப்படும் ஒளிரும் சிக்னல் தணிக்கும் குழுவால் உறிஞ்சப்படுகிறது;PCR பெருக்கத்தின் போது, ​​Taq நொதியின் 5′-3′ exonuclease செயல்பாடு, ஆய்வை பிளவுபடுத்துகிறது மற்றும் சிதைக்கிறது, இது நிருபர் ஃப்ளோரசன்ட் குழுவாகவும், ஃப்ளோரசன்ட் குழுவாகவும் பிரிக்கப்படுகிறது, இதனால் ஃப்ளோரசன்ஸ் கண்காணிப்பு அமைப்பு ஃப்ளோரசன்ஸ் சிக்னலைப் பெறுகிறது, அதாவது ஒவ்வொரு முறையும் ஒரு ஒளிரும் ஒளிமயமாக உருவாகிறது. ஃப்ளோரசன்ஸ் சிக்னலின் லேஷன் பிசிஆர் தயாரிப்பின் உருவாக்கத்துடன் முழுமையாக ஒத்திசைக்கப்படுகிறது.

2) SYBR ஃப்ளோரசன்ட் சாயங்கள்:

PCR எதிர்வினை அமைப்பில், SYBR ஃப்ளோரசன்ட் சாயம் அதிகமாக சேர்க்கப்படுகிறது.SYBR ஃப்ளோரசன்ட் சாயம் டிஎன்ஏ இரட்டை இழையில் குறிப்பாக இணைக்கப்படாத பிறகு, அது ஒரு ஒளிரும் சமிக்ஞையை வெளியிடுகிறது.சங்கிலியில் இணைக்கப்படாத SYBR சாய மூலக்கூறு எந்த ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னலையும் வெளியிடாது, அதன் மூலம் ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னலை உறுதி செய்கிறது PCR தயாரிப்புகளின் அதிகரிப்பு PCR தயாரிப்புகளின் அதிகரிப்புடன் முழுமையாக ஒத்திசைக்கப்படுகிறது.SYBR ஆனது இரட்டை இழையுடைய DNA உடன் மட்டுமே பிணைக்கிறது, எனவே PCR எதிர்வினை குறிப்பிட்டதா என்பதை தீர்மானிக்க உருகும் வளைவைப் பயன்படுத்தலாம்.

3) மூலக்கூறு பீக்கான்கள்

இது ஒரு ஸ்டெம்-லூப் இரட்டை-லேபிளிடப்பட்ட ஒலிகோநியூக்ளியோடைடு ஆய்வு ஆகும், இது 5 மற்றும் 3 முனைகளில் சுமார் 8 தளங்களின் ஹேர்பின் அமைப்பை உருவாக்குகிறது.இரு முனைகளிலும் உள்ள நியூக்ளிக் அமில வரிசைகள் இணையாக இணைகின்றன, இதனால் ஃப்ளோரசன்ட் குழு மற்றும் தணிக்கும் குழு இறுக்கமாக இருக்கும்.மூடினால், அது ஃப்ளோரசன்ஸை உருவாக்காது.

பிசிஆர் தயாரிப்பு உருவாக்கப்பட்ட பிறகு, அனீலிங் செயல்பாட்டின் போது, ​​மூலக்கூறு கலங்கரை விளக்கின் நடுப்பகுதி ஒரு குறிப்பிட்ட டிஎன்ஏ வரிசையுடன் இணைக்கப்படுகிறது, மேலும் ஃப்ளோரசன்ட் மரபணுவை தணிக்கும் மரபணுவிலிருந்து பிரிக்கப்பட்டு ஒளிரும் தன்மையை உருவாக்குகிறது.

இரண்டாம் தலைமுறை PCR இன் முக்கிய தீமைகள்:

உணர்திறன் இன்னும் குறைவாக உள்ளது, மேலும் குறைந்த நகல் மாதிரிகளைக் கண்டறிவது துல்லியமாக இல்லை.

பின்னணி மதிப்பு செல்வாக்கு உள்ளது, மேலும் இதன் விளைவாக குறுக்கீடு ஏற்பட வாய்ப்புள்ளது.

மூன்றாம் தலைமுறை டிஜிட்டல் பிசிஆர்

டிஜிட்டல் PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) இலக்கு வரிசையின் நகல் எண்ணை எண்ட்-பாயின்ட் கண்டறிதல் மூலம் கணக்கிடுகிறது, மேலும் உள் கட்டுப்பாடுகள் மற்றும் நிலையான வளைவுகளைப் பயன்படுத்தாமல் துல்லியமான முழுமையான அளவு கண்டறிதலைச் செய்ய முடியும்.

டிஜிட்டல் PCR இறுதிப்புள்ளி கண்டறிதலைப் பயன்படுத்துகிறது மற்றும் Ct மதிப்பை (சுழற்சி வரம்பு) சார்ந்தது அல்ல, எனவே டிஜிட்டல் PCR எதிர்வினை பெருக்கத் திறனால் குறைவாகவே பாதிக்கப்படுகிறது, மேலும் PCR எதிர்வினை தடுப்பான்களுக்கான சகிப்புத்தன்மை உயர் துல்லியம் மற்றும் மறுஉற்பத்தித்திறனுடன் மேம்படுத்தப்படுகிறது.

அதிக உணர்திறன் மற்றும் அதிக துல்லியத்தின் பண்புகள் காரணமாக, இது PCR எதிர்வினை தடுப்பான்களால் எளிதில் குறுக்கிடப்படாது, மேலும் இது நிலையான தயாரிப்புகள் இல்லாமல் உண்மையான முழுமையான அளவை அடைய முடியும், இது ஒரு ஆராய்ச்சி மற்றும் பயன்பாட்டு ஹாட்ஸ்பாடாக மாறியுள்ளது.

எதிர்வினை அலகு வெவ்வேறு வடிவங்களின்படி, அதை மூன்று வகைகளாகப் பிரிக்கலாம்: மைக்ரோஃப்ளூய்டிக், சிப் மற்றும் துளி அமைப்புகள்.