qPCR சோதனைகளில், ப்ரைமர் வடிவமைப்பும் மிக முக்கியமான இணைப்பாகும்.ப்ரைமர்கள் பொருத்தமானதா இல்லையா என்பது, பெருக்க செயல்திறன் தரநிலையை அடைகிறதா, பெருக்கப்பட்ட தயாரிப்புகள் குறிப்பிட்டதா, மற்றும் பரிசோதனை முடிவுகள் கிடைக்குமா என்பவற்றுடன் நெருங்கிய தொடர்புடையது.
எனவே qPCR ப்ரைமர் விவரக்குறிப்பை எவ்வாறு சிறப்பாகச் செய்வது?உயர் பெருக்க திறன்?
இன்று, qPCR ப்ரைமர்களை ஒன்றாக வடிவமைக்க நாங்கள் உங்களை அழைத்துச் செல்வோம், மேலும் qPCR ப்ரைமர் வடிவமைப்பு சோதனைகளில் திறமையான லோர் திறனாக மாறட்டும்.
qPCR ப்ரைமர்களை வடிவமைக்கும் போது, ​​வழக்கமாக பின்வரும் புள்ளிகளுக்கு கவனம் செலுத்துங்கள்: ப்ரைமர்கள் முடிந்தவரை இன்ட்ரான்கள் முழுவதும் வடிவமைக்கப்பட வேண்டும், தயாரிப்பு நீளம் 100-300 bp இருக்க வேண்டும், Tm மதிப்பு 60 ° C க்கு அருகில் இருக்க வேண்டும், மேலும் அப்ஸ்ட்ரீம் மற்றும் கீழ்நிலை ப்ரைமர்கள் முடிந்தவரை நெருக்கமாக இருக்க வேண்டும், மேலும் ப்ரைமரின் முடிவு G அல்லது C ஆக இருக்க வேண்டும்.
1. ப்ரைமர்களின் வடிவமைப்பு
qPCR ப்ரைமர்களை வடிவமைக்கும் போது, ​​இன்ட்ரான்கள் முழுவதும் வடிவமைக்கப்பட்ட ப்ரைமர்களைத் தேர்ந்தெடுப்பது gDNA டெம்ப்ளேட்டைப் பெருக்குவதைத் தடுக்கலாம், மேலும் தயாரிப்புகள் அனைத்தும் cDNA இன் பெருக்கத்திலிருந்து பெறப்படுகின்றன, இதனால் gDNA மாசுபாட்டின் தாக்கத்தை நீக்குகிறது.
2. ப்ரைமர் நீளம்
ப்ரைமரின் நீளம் பொதுவாக 18-30 nt வரை இருக்கும், மேலும் பெருக்கப் பொருளின் நீளம் முடிந்தவரை 100-300 bp வரை கட்டுப்படுத்தப்பட வேண்டும்.
ப்ரைமர் மிகவும் குறுகியதாக இருந்தால், அது குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்திற்கு வழிவகுக்கும், மேலும் அது மிக நீளமாக இருந்தால், அது எளிதாக இரண்டாம் நிலை அமைப்பை உருவாக்கும் (ஹேர்பின் அமைப்பு போன்றவை).பெருக்க தயாரிப்பு மிக நீளமாக இருந்தால், அது பாலிமரேஸின் எதிர்வினைக்கு ஏற்றது அல்ல, இது PCR பெருக்கத்தின் செயல்திறனை பாதிக்கும்.
3. GC உள்ளடக்கம் மற்றும் Tm மதிப்பு
ப்ரைமர்களின் GC உள்ளடக்கம் 40% முதல் 60% வரை கட்டுப்படுத்தப்பட வேண்டும்.அது மிக அதிகமாகவோ அல்லது மிகக் குறைவாகவோ இருந்தால், அது எதிர்வினையைத் தொடங்குவதற்கு உகந்ததல்ல.ஒரே டிஎம் மதிப்பு மற்றும் அனீலிங் வெப்பநிலையைப் பெற, முன்னோக்கி மற்றும் தலைகீழ் ப்ரைமர்களின் ஜிசி உள்ளடக்கம் ஒரே மாதிரியாக இருக்க வேண்டும்.
Tm மதிப்பு முடிந்தவரை 55-65°Cக்கு இடையில் இருக்க வேண்டும், பொதுவாக சுமார் 60°C ஆக இருக்க வேண்டும், மேலும் மேல்நிலை மற்றும் கீழ்நிலையின் Tm மதிப்பு முடிந்தவரை நெருக்கமாக இருக்க வேண்டும், முன்னுரிமை 4°Cக்கு மிகாமல் இருக்க வேண்டும்.
4. ப்ரைமரின் 3′ இறுதியில் A ஐத் தேர்ந்தெடுப்பதைத் தவிர்க்கவும்
ப்ரைமரின் 3′ முடிவு பொருந்தாதபோது, ​​வெவ்வேறு தளங்களின் தொகுப்புத் திறனில் பெரும் வேறுபாடுகள் உள்ளன.கடைசி அடிப்படை A ஆக இருக்கும் போது, ​​அது பொருந்தாத நிலையிலும் கூட சங்கிலித் தொகுப்பைத் தொடங்கலாம், மேலும் கடைசி அடிப்படை T எப்போது , பொருந்தாத தூண்டுதலின் செயல்திறன் வெகுவாகக் குறைக்கப்படுகிறது.எனவே, ப்ரைமரின் 3′ முடிவில் A ஐத் தேர்ந்தெடுப்பதைத் தவிர்க்க முயற்சிக்கவும், மேலும் T ஐத் தேர்ந்தெடுப்பது நல்லது.
இது ஒரு ஆய்வு ப்ரைமராக இருந்தால், ஆய்வின் 5′ முடிவு G ஆக இருக்க முடியாது, ஏனெனில் FAM ஃப்ளோரசன்ட் நிருபர் குழுவுடன் ஒரு G அடிப்படை இணைக்கப்பட்டிருந்தாலும் கூட, G ஆனது FAM குழுவால் உமிழப்படும் ஒளிரும் சமிக்ஞையைத் தணிக்க முடியும், இதன் விளைவாக தவறான எதிர்மறை முடிவுகள் ஏற்படும்.தோன்றும்.
5. அடிப்படை விநியோகம்
ப்ரைமரில் உள்ள நான்கு தளங்களின் விநியோகம் சீரற்றதாக இருக்கும், 3′ முடிவில் 3 க்கும் மேற்பட்ட G அல்லது C ஐத் தவிர்த்து, 3 க்கும் மேற்பட்ட தொடர்ச்சியானதுG அல்லது C ஆனது GC நிறைந்த வரிசைப் பகுதியில் இணைப்பினை உருவாக்குவது எளிது.
6. ப்ரைமர் வடிவமைப்பு பகுதி சிக்கலான இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்புகளை தவிர்க்க வேண்டும்.
பெருக்க உற்பத்தியின் ஒற்றை இழையால் உருவாக்கப்பட்ட இரண்டாம் நிலை அமைப்பு PCR இன் சீரான முன்னேற்றத்தை பாதிக்கும்.இலக்கு வரிசையில் இரண்டாம் நிலை அமைப்பு உள்ளதா என்பதை முன்கூட்டியே கணிப்பதன் மூலம், ப்ரைமர்களின் வடிவமைப்பில் இந்த பகுதியைத் தவிர்க்க முயற்சிக்கவும்.
7. ப்ரைமர்கள் மற்றும் ப்ரைமர்களுக்கு இடையில் தொடர்ச்சியான நிரப்பு தளங்களைத் தவிர்க்க முயற்சிக்க வேண்டும்.
ப்ரைமருக்கும் ப்ரைமருக்கும் இடையில் தொடர்ச்சியான 4 அடிப்படை நிரப்புத்தன்மை இருக்க முடியாது.ப்ரைமருக்கு ஒரு நிரப்பு வரிசை இருக்கக்கூடாது, இல்லையெனில் அது ஒரு ஹேர்பின் அமைப்பை உருவாக்குவதற்கு தன்னை மடித்துக் கொள்ளும், இது ப்ரைமர் மற்றும் டெம்ப்ளேட்டின் அனீலிங் கலவையை பாதிக்கும்.
அப்ஸ்ட்ரீம் மற்றும் கீழ்நிலை ப்ரைமர்களுக்கு இடையில் நிரப்பு வரிசைகள் இருக்க முடியாது.ப்ரைமர்களுக்கிடையேயான நிரப்புத்தன்மை ப்ரைமர் டைமர்களை உருவாக்கும், இது PCR செயல்திறனைக் குறைக்கும் மற்றும் அளவு துல்லியத்தையும் பாதிக்கும்.ப்ரைமர்-டைமர் மற்றும் ஹேர்பின் கட்டமைப்புகள் தவிர்க்க முடியாததாக இருந்தால், △G மதிப்பு மிக அதிகமாக இருக்கக்கூடாது (4.5 kcal/mol க்கும் குறைவாக இருக்க வேண்டும்).
8. ப்ரைமர்கள் இலக்கு குறிப்பிட்ட தயாரிப்பைப் பெருக்குகின்றன.
qPCR கண்டறிதலின் இறுதி இலக்கு இலக்கு மரபணுவின் மிகுதியைப் புரிந்துகொள்வதாகும்.குறிப்பிடப்படாத பெருக்கம் ஏற்பட்டால், அளவீடு துல்லியமாக இருக்காது.எனவே, ப்ரைமர்கள் வடிவமைக்கப்பட்ட பிறகு, அவை BLAST மூலம் சோதிக்கப்பட வேண்டும், மேலும் தயாரிப்புகளின் தனித்தன்மை வரிசை தரவுத்தளத்தில் ஒப்பிடப்படுகிறது.
அடுத்து, qPCR ப்ரைமர்களை வடிவமைக்க மனித GAS6 (வளர்ச்சி தடுப்பு குறிப்பிட்ட 6) மரபணுவை உதாரணமாக எடுத்துக்கொள்கிறோம்.
01 வினவல் மரபணு
ஹோமோ GAS6NCBI மூலம்.இங்கே, மரபணு பெயர் மற்றும் இனங்கள் சீரானவை என்பதை உறுதிப்படுத்த அவற்றை ஒப்பிடுவதில் நாம் கவனம் செலுத்த வேண்டும்.
02 மரபணு வரிசையைக் கண்டறியவும்
(1) இலக்கு வரிசை மரபணு டிஎன்ஏ என்றால், முதலில் ஒன்றைத் தேர்ந்தெடுக்கவும், இது மரபணுவின் மரபணு டிஎன்ஏ வரிசையாகும்.
(2) இலக்கு வரிசை mRNA என்றால், இரண்டாவது ஒன்றைத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.உள்ளிட்ட பிறகு, கீழே உள்ள அட்டவணையில் "CDS" என்பதைக் கிளிக் செய்யவும்.பழுப்பு பின்னணி வரிசை என்பது மரபணுவின் குறியீட்டு வரிசையாகும்.
03 டிசைன் ப்ரைமர்கள்
Primer-BLAST இடைமுகத்தை உள்ளிடவும்
மேல் இடதுபுறத்தில் ஃபாஸ்டா வடிவத்தில் மரபணு வரிசை எண் அல்லது வரிசையை உள்ளிட்டு, தொடர்புடைய அளவுருக்களை நிரப்பவும்.

"ப்ரைமர்களைப் பெறு" என்பதைக் கிளிக் செய்யவும், அத்தகைய அளவுரு தேர்வு மற்ற பிளவுபடுத்தும் வகைகளுக்குப் பெருக்கப்படும் என்பதை உங்களுக்குத் தெரிவிக்க NCBI பாப் அப் செய்யும்.நாம் வெவ்வேறு பிளவுபடுத்தும் வகைகளைச் சரிபார்த்து, பொருத்தமான ப்ரைமர் ஜோடியைப் பெற அவற்றைச் சமர்ப்பிக்கலாம் (கீழே உள்ள படத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளபடி).இந்த செயல்முறை இயங்குவதற்கு பத்து வினாடிகள் ஆகலாம்.
இந்த ப்ரைமர் ஜோடிகளின் அனீலிங் வெப்பநிலை அனைத்தும் சுமார் 60 டிகிரி செல்சியஸ் ஆகும்.பரிசோதனையின் நோக்கத்தின்படி, பரிசோதனைக்கான ப்ரைமர்களின் மிதமான நீளம், நல்ல விவரக்குறிப்பு மற்றும் குறைவான சுய-நிறைவு கொண்ட ப்ரைமர்களைத் தேர்வுசெய்து, வெற்றி விகிதம் மிகவும் அதிகமாக உள்ளது!
04 ப்ரைமர் விவரக்குறிப்பு சரிபார்ப்பு
உண்மையில், ப்ரைமர்களை வடிவமைப்பதோடு, நாமே வடிவமைத்த ப்ரைமர்களையும் ப்ரைமர்-ப்ளாஸ்ட் மதிப்பீடு செய்யலாம்.ப்ரைமர் வடிவமைப்பு பக்கத்திற்குத் திரும்பி, நாங்கள் வடிவமைத்த அப்ஸ்ட்ரீம் மற்றும் கீழ்நிலை ப்ரைமர்களை உள்ளிடவும், மற்ற அளவுருக்கள் சரிசெய்யப்படாது.சமர்ப்பித்த பிறகு, ப்ரைமர்களின் ஜோடி மற்ற மரபணுக்களிலும் உள்ளதா என்பதை நீங்கள் பார்க்கலாம்.அவை அனைத்தும் நாம் பெருக்க விரும்பும் மரபணுவில் காட்டப்பட்டால், இந்த ஜோடி ப்ரைமர்களின் தனித்தன்மை சிறந்தது என்பதைக் குறிக்கிறது!(உதாரணமாக, ப்ரைமர் வினவலின் ஒரே முடிவு இதுதான்!)

05 ப்ரைமர் தர தீர்ப்பு
"சரியான" ப்ரைமர் என்ன வகையான ப்ரைமர் ஆகும், இது "பெருக்க செயல்திறன் தரநிலை வரை", "பெருக்கி தயாரிப்பு பண்புகள்" மற்றும் "நம்பகமான சோதனை முடிவுகள்" ஆகியவற்றை இணைக்கிறது?
பெருக்க திறன்

உருகும் வளைவு
ப்ரைமர்களின் பெருக்க செயல்திறன் 90%-110% ஐ அடைகிறது, அதாவது பெருக்க திறன் நன்றாக உள்ளது, மேலும் உருகும் வளைவில் ஒரு உச்சநிலை மற்றும் பொதுவாக Tm>80 ° C உள்ளது, அதாவது பெருக்க விவரக்குறிப்பு நன்றாக உள்ளது.
 
தொடர்புடைய தயாரிப்புகள்:
ரியல் டைம் பிசிஆர் ஈஸி–சைபிஆர் க்ரீன் ஐ
ரியல் டைம் பிசிஆர் ஈஸி-தக்மான்