• முகநூல்
  • இணைக்கப்பட்ட
  • வலைஒளி

 Fluorescence quantitative PCR (TakMan PCR என்றும் அழைக்கப்படுகிறது, இனி FQ-PCR என்றும் குறிப்பிடப்படுகிறது) என்பது 1995 ஆம் ஆண்டில் அமெரிக்காவில் PE (பெர்கின் எல்மர்) உருவாக்கிய ஒரு புதிய நியூக்ளிக் அமில அளவு தொழில்நுட்பமாகும்.நெகிழ்வான PCR உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​FQ-PCR அதன் அளவு செயல்பாட்டை உணர பல நன்மைகளைக் கொண்டுள்ளது.இந்த கட்டுரை தொழில்நுட்பத்தின் பண்புகள், கொள்கைகள், முறைகள் மற்றும் பயன்பாடுகளை சுருக்கமாக விவரிக்க விரும்புகிறது.

1 அம்சங்கள்

FQ-PCR ஆனது சாதாரண PCR இன் அதிக உணர்திறன் மட்டுமல்ல, ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வுகளின் பயன்பாட்டின் காரணமாகவும், ஒளிமின்னழுத்த கடத்தல் அமைப்பின் மூலம் PCR பெருக்கத்தின் போது ஒளிரும் சமிக்ஞையின் மாற்றத்தை நேரடியாகக் கண்டறிந்து அளவு முடிவுகளைப் பெற முடியும், இது வழக்கமான PCR இன் பல குறைபாடுகளை சமாளிக்கிறது.

எடுத்துக்காட்டாக, பொது PCR தயாரிப்புகளை புற ஊதா ஒளியுடன் கூடிய அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மற்றும் எத்திடியம் புரோமைடு கறை அல்லது பாலிஅக்ரிலாமைடு ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மற்றும் சில்வர் ஸ்டைனிங் மூலம் கவனிக்க வேண்டும்.இதற்கு பல கருவிகள் தேவைப்படுவது மட்டுமல்லாமல், நேரத்தையும் முயற்சியையும் எடுக்கும்.எத்திடியம் புரோமைடு பயன்படுத்தப்படும் கறை மனித உடலுக்கு தீங்கு விளைவிக்கும், மேலும் இந்த சிக்கலான சோதனை நடைமுறைகள் மாசு மற்றும் தவறான நேர்மறைகளுக்கு வாய்ப்புகளை வழங்குகின்றன.இருப்பினும், மாதிரி ஏற்றும் போது FQ-PCR ஆனது மூடியை ஒருமுறை மட்டுமே திறக்க வேண்டும், அதன்பின் வரும் செயல்முறை முற்றிலும் மூடிய-குழாய் இயக்கமாகும், இதற்கு PCR பிந்தைய செயலாக்கம் தேவையில்லை, வழக்கமான PCR செயல்பாடுகளில் பல குறைபாடுகளைத் தவிர்க்கிறது.சோதனையானது பொதுவாக PE நிறுவனத்தால் உருவாக்கப்பட்ட ABI7100 PCR வெப்ப சுழற்சியைப் பயன்படுத்துகிறது.

கருவி பின்வரும் குணாதிசயங்களைக் கொண்டுள்ளது: ① பரந்த பயன்பாடு: இது டிஎன்ஏ மற்றும் ஆர்என்ஏ பிசிஆர் தயாரிப்பு அளவீடு, மரபணு வெளிப்பாடு ஆராய்ச்சி, நோய்க்கிருமி கண்டறிதல் மற்றும் பிசிஆர் நிலைமைகளை மேம்படுத்துதல் ஆகியவற்றிற்கு பயன்படுத்தப்படலாம்.② தனித்துவமான அளவுக் கொள்கை: ஃப்ளோரசன்ட் லேபிளிடப்பட்ட ஆய்வுகளைப் பயன்படுத்தி, லேசர் தூண்டுதலுக்குப் பிறகு பிசிஆர் சுழற்சியில் ஃப்ளோரசன்ஸின் அளவு குவிந்து, அளவீட்டு நோக்கத்தை அடையும்.③ அதிக வேலைத்திறன்: உள்ளமைக்கப்பட்ட 9600 PCR வெப்ப சுழற்சி, 96 மாதிரிகளின் பெருக்கம் மற்றும் அளவீடுகளை தானாகவும் ஒத்திசைவாகவும் முடிக்க கணினி 1 முதல் 2 மணிநேரம் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது.④ ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் தேவையில்லை: மாதிரியை நீர்த்துப்போகச் செய்து எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் செய்ய வேண்டியதில்லை, எதிர்வினைக் குழாயில் நேரடியாகக் கண்டறிய ஒரு சிறப்பு ஆய்வைப் பயன்படுத்தவும்.⑤குழாயில் எந்த மாசுபாடும் இல்லை: தனித்துவமான முழுமையாக மூடப்பட்ட எதிர்வினை குழாய் மற்றும் ஒளிமின்னழுத்த கடத்தல் அமைப்பு ஏற்றுக்கொள்ளப்பட்டது, எனவே மாசுபாடு பற்றி கவலைப்பட வேண்டிய அவசியமில்லை.⑥முடிவுகள் மீண்டும் உருவாக்கக்கூடியவை: அளவு மாறும் வரம்பு அளவு ஐந்து ஆர்டர்கள் வரை இருக்கும்.எனவே, இந்த தொழில்நுட்பம் வெற்றிகரமாக உருவாக்கப்பட்டதிலிருந்து, இது பல அறிவியல் ஆராய்ச்சியாளர்களால் மதிப்பிடப்பட்டது மற்றும் பல துறைகளில் பயன்படுத்தப்பட்டது.

2 கொள்கைகள் மற்றும் முறைகள்

FQ-PCR இன் செயல்பாட்டுக் கொள்கையானது, PCR எதிர்வினை அமைப்பில் ஒளிரும் லேபிளிடப்பட்ட ஆய்வைச் சேர்க்க, Taq நொதியின் 5′→3′ exonuclease செயல்பாட்டைப் பயன்படுத்துவதாகும்.ப்ரைமர் சீக்வென்ஸில் உள்ள டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட்டுடன் ஆய்வு குறிப்பாக கலப்பினம் செய்ய முடியும்.ஆய்வின் 5′இறுதியானது ஃப்ளோரசன்ஸ் உமிழ்வு மரபணு FAM (6-கார்பாக்சிஃப்ளோரெசின், ஃப்ளோரசன்ஸ் உமிழ்வு உச்சம் 518nm) உடன் லேபிளிடப்பட்டுள்ளது, மேலும் 3′இறுதியானது ஃப்ளோரசன்ஸ் தணிக்கும் குழு TAMRA (6-carboxytetrametramethylroxytetramethyl5, 8) என பெயரிடப்பட்டுள்ளது. பிசிஆர் பெருக்கத்தின் போது ஆய்வு நீட்டிக்கப்படுவதைத் தடுக்க, ஆய்வின் ஆரம்பம் பாஸ்போரிலேட்டட் செய்யப்படுகிறது.ஆய்வு அப்படியே இருக்கும் போது, ​​உமிழும் குழுவின் ஃப்ளோரசன்ஸ் உமிழ்வை தணிக்கும் குழு அடக்குகிறது.உமிழும் குழுவை தணிக்கும் குழுவிலிருந்து பிரித்தவுடன், தடுப்பு நீக்கப்பட்டு, 518nm இல் ஆப்டிகல் அடர்த்தி அதிகரிக்கிறது மற்றும் ஃப்ளோரசன் கண்டறிதல் அமைப்பால் கண்டறியப்படுகிறது. மறுபிறப்பு கட்டத்தில், ஆய்வு டெம்ப்ளேட்டுடன் டிஎன்ஏவுடன் கலப்பினமாகும், மேலும் டிஎன்ஏ நீட்டிப்பு கட்டத்தில் உள்ள டாக் என்சைம் பிரைம் டெம்ப்ளேட்டுடன் நகர்கிறது.ஆய்வு துண்டிக்கப்படும் போது, ​​தணிக்கும் விளைவு வெளியிடப்படுகிறது மற்றும் ஃப்ளோரசன்ட் சமிக்ஞை வெளியிடப்படுகிறது.ஒவ்வொரு முறையும் டெம்ப்ளேட் நகலெடுக்கப்படும்போது, ​​​​ஒரு ஆய்வு துண்டிக்கப்படுகிறது, அதனுடன் ஒரு ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னல் வெளியிடப்படுகிறது.வெளியிடப்பட்ட ஃப்ளோரோஃபோர்களின் எண்ணிக்கைக்கும் PCR தயாரிப்புகளின் எண்ணிக்கைக்கும் இடையே ஒன்றுக்கு ஒன்று தொடர்பு இருப்பதால், டெம்ப்ளேட்டைத் துல்லியமாக அளவிட இந்த நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தலாம்.சோதனை கருவி பொதுவாக PE நிறுவனத்தால் உருவாக்கப்பட்ட ABI7100 PCR வெப்ப சுழற்சியைப் பயன்படுத்துகிறது, மேலும் பிற வெப்ப சுழற்சிகளையும் பயன்படுத்தலாம்.ABI7700 எதிர்வினை வகை எதிர்வினை அமைப்பு பரிசோதனைக்கு பயன்படுத்தப்பட்டால், எதிர்வினை முடிந்ததும், கணினி பகுப்பாய்வு மூலம் அளவு முடிவுகளை நேரடியாக வழங்க முடியும்.நீங்கள் மற்ற வெப்ப சுழற்சிகளைப் பயன்படுத்தினால், RQ+, RQ-, △RQ ஆகியவற்றைக் கணக்கிட, அதே நேரத்தில் எதிர்வினைக் குழாயில் உள்ள ஒளிரும் சமிக்ஞையை அளவிட, ஃப்ளோரசன்ஸ் டிடெக்டரைப் பயன்படுத்த வேண்டும்.RQ+ என்பது மாதிரிக் குழாயின் ஒளிரும் உமிழ்வுக் குழுவின் ஒளிர்வுத் தீவிரத்திற்கும், தணிக்கும் குழுவின் ஒளிர்வுத் தீவிரத்திற்கும் உள்ள விகிதத்தைக் குறிக்கிறது, RQ- என்பது வெற்றுக் குழாயில் உள்ள இரண்டின் விகிதத்தைக் குறிக்கிறது.ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வுகளின் அறிமுகம் காரணமாக, பரிசோதனையின் தனித்தன்மை கணிசமாக மேம்படுத்தப்பட்டுள்ளது.ஆய்வு வடிவமைப்பு பொதுவாக பின்வரும் நிபந்தனைகளை பூர்த்தி செய்ய வேண்டும்: ①பிணைப்பின் தனித்தன்மையை உறுதிப்படுத்த ஆய்வின் நீளம் சுமார் 20-40 தளங்களாக இருக்க வேண்டும்.②சிங்கிள் நியூக்ளியோடைடு வரிசைகளின் நகல்களைத் தவிர்க்க GC தளங்களின் உள்ளடக்கம் 40% முதல் 60% வரை இருக்கும்.③ கலப்பினத்தைத் தவிர்க்கவும் அல்லது ப்ரைமர்களுடன் ஒன்றுடன் ஒன்று சேர்வதைத் தவிர்க்கவும்.④ ஆய்வுக்கும் டெம்ப்ளேட்டிற்கும் இடையிலான பிணைப்பின் நிலைத்தன்மை, ப்ரைமருக்கும் டெம்ப்ளேட்டிற்கும் இடையிலான பிணைப்பின் நிலைத்தன்மையை விட அதிகமாக உள்ளது, எனவே ஆய்வின் Tm மதிப்பு ப்ரைமரின் Tm மதிப்பை விட குறைந்தது 5 ° C அதிகமாக இருக்க வேண்டும்.கூடுதலாக, ஆய்வின் செறிவு, ஆய்வு மற்றும் டெம்ப்ளேட் வரிசைக்கு இடையே உள்ள ஹோமோலஜி மற்றும் ஆய்வு மற்றும் ப்ரைமருக்கு இடையிலான தூரம் அனைத்தும் சோதனை முடிவுகளில் தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகின்றன.

தொடர்புடைய தயாரிப்புகள்:

China Lnc-RT Heroᵀᴹ I(gDNase உடன்)(lncRNA இலிருந்து முதல் ஸ்ட்ராண்ட் cDNA தொகுப்புக்கான சூப்பர் பிரீமிக்ஸ்) உற்பத்தியாளர் மற்றும் சப்ளையர் |Foregene (foreivd.com)

சீனா ரியல் டைம் PCR Easyᴹ-Taqman உற்பத்தியாளர் மற்றும் சப்ளையர் |Foregene (foreivd.com)


பின் நேரம்: அக்டோபர்-15-2021