• முகநூல்
  • இணைக்கப்பட்ட
  • வலைஒளி

PCR வினைகளின் ஆரம்ப கட்டத்தில் ப்ரைமர்கள் மற்றும் ஆய்வுகளின் செயல்திறனைச் சரிபார்ப்பது மற்றும் மிகவும் பொருத்தமான எதிர்வினை நிலைமைகளைத் தீர்மானிப்பது முறையான சோதனைகளின் சீரான முன்னேற்றத்தை உறுதி செய்வதற்கான முன்நிபந்தனைகள் ஆகும்.

ஆரம்ப கட்டத்தில் ப்ரைமர் ஆய்வை எவ்வாறு உறுதிப்படுத்த வேண்டும்?

முக்கிய குறிகாட்டிகள் அடிப்படை, பெருக்க வளைவு, ct மதிப்பு, பெருக்க திறன், குறைந்த செறிவு மாதிரி கண்டறிதல், CV போன்றவை.

அடிப்படை

அடிப்படையானது PCR பெருக்க வளைவில் உள்ள கிடைமட்ட கோடு ஆகும்.PCR பெருக்க வினையின் முதல் சில சுழற்சிகளில், ஃப்ளோரசன்ஸ் சிக்னல் பெரிதாக மாறாது மற்றும் நேர்கோட்டை உருவாக்குகிறது.இந்த நேர்கோடு அடிப்படை.

PCR ப்ரைமர் ஆய்வுகளை திரையிடும் போது, ​​அடிப்படை நிலை மட்டத்தில் உள்ளதா என்பதைக் கவனிக்கவும்.ப்ரைமர் ப்ரோப் செறிவூட்டலின் தூய்மையானது பேஸ்லைனைப் பாதிக்கும், அதாவது பேஸ்லைன் உயரும் அல்லது குறையும்.அடிப்படையானது மிகவும் உள்ளுணர்வு குறிகாட்டியாகும்.
பகுப்பாய்வு

பெருக்க வளைவு

மற்றொரு உள்ளுணர்வு காட்டி பெருக்க வளைவின் வடிவம்.இரண்டாம் நிலை பெருக்கம் அல்லது பிற அசாதாரண பெருக்க வளைவுகளைத் தவிர்க்க S- வடிவ வளைவை வைத்திருப்பது சிறந்தது.
ஏதுமில்லை

Ct மதிப்பு

அடிப்படையிலிருந்து அதிவேக வளர்ச்சி வரையிலான ஊடுருவல் புள்ளியுடன் தொடர்புடைய சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை Ct மதிப்பு.

ஒரே மாதிரிக்கு, வெவ்வேறு ப்ரைமர் ஆய்வுகள் வெவ்வேறு பெருக்க வளைவுகளில் விளைகின்றன, மேலும் தொடர்புடைய Ct மதிப்பு பெருக்க செயல்திறன் மற்றும் குறுக்கீடு பட்டத்தால் பாதிக்கப்படும்.கோட்பாட்டில், நாம் தேர்ந்தெடுக்கும் ப்ரைமர் ஆய்வின் Ct மதிப்பு சிறியது, சிறந்தது.

பகுப்பாய்வு-3

பெருக்க திறன்

PCR பெருக்க செயல்திறனை மதிப்பிடுவதற்கான மிகவும் நம்பகமான மற்றும் நிலையான முறைகளில் ஒன்று நிலையான வளைவு ஆகும், இது ஆராய்ச்சியாளர்களால் பரவலாக அங்கீகரிக்கப்பட்டுள்ளது.இலக்கு வார்ப்புருக்களின் ஒப்பீட்டு எண்ணிக்கையைக் கட்டுப்படுத்த தொடர்ச்சியான மாதிரிகளை உருவாக்குவது இந்த முறை ஆகும்.இந்த மாதிரிகள் பொதுவாக செறிவூட்டப்பட்ட பங்குத் தீர்வுகளின் தொடர் நீர்த்துப்போகச் செய்யப்படுகின்றன, பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படுவது 10-மடங்கு நீர்த்தல் ஆகும்.நீர்த்த மாதிரிகளின் வரிசையைப் பயன்படுத்தி, நிலையான qPCR நிரலைப் பயன்படுத்தி Cq மதிப்பைப் பெருக்கி, இறுதியாக ஒவ்வொரு மாதிரியின் செறிவு மற்றும் Cq= -klgX0+b மற்றும் பெருக்கத் திறன் E=10(-1 /k)-1 ஆகியவற்றைப் பெற தொடர்புடைய Cq மதிப்பின் படி நிலையான வளைவை வரையவும்.அளவு பகுப்பாய்வுக்காக qPCR ஐப் பயன்படுத்தும் போது, ​​பெருக்க திறன் 90%-110% (3.6>k>3.1) வரம்பில் இருக்க வேண்டும்.

பகுப்பாய்வு-4

குறைந்த செறிவு மாதிரிகள் கண்டறிதல்

மாதிரி செறிவு குறைவாக இருக்கும்போது, ​​வெவ்வேறு ப்ரைமர் ஆய்வுகளின் கண்டறிதல் விகிதங்கள் வேறுபட்டவை.நகலெடுக்க 20 குறைந்த செறிவு மாதிரிகளைத் தேர்ந்தெடுக்கிறோம், மேலும் அதிக கண்டறிதல் விகிதத்தைக் கொண்ட ப்ரைமர்-புரோப் அமைப்பு சிறந்தது.

பகுப்பாய்வு-5

மாறுபாட்டின் குணகம் (CV)

நியூக்ளிக் அமிலம் பெருக்கக் கண்டறிதலுக்கான ரீஜெண்டின் வரித் தரத்தின்படி வெவ்வேறு ப்ரைமர் ஆய்வுகள் மூலம் 10 நகல் மாதிரிகளைக் கண்டறியலாம்.

பகுப்பாய்வு-6

அளவு எதிர்வினைகள்:
துல்லியம்
ஒரு தொகுதிக்குள் உள்ள துல்லியம் சந்திக்க வேண்டும்: சோதனை செறிவின் மடக்கை மதிப்பின் மாறுபாட்டின் குணகம் (CV,%) ≤5% ஆகும்.மாதிரி செறிவு குறைவாக இருக்கும்போது, ​​கண்டறிதல் செறிவின் மடக்கையின் மாறுபாட்டின் குணகம் (CV,%) ≤10%


தரமான எதிர்வினைகள்:
துல்லியம்
ஒரு தொகுதிக்குள் உள்ள துல்லியம் சந்திக்க வேண்டும்:

(1) Ct மதிப்பின் மாறுபாட்டின் குணகம் (CV,%) ≤5%

அதே மாதிரி 10 முறை இணையாக சோதிக்கப்படுகிறது, மேலும் சோதனை முடிவுகள் சீரானதாக இருக்க வேண்டும்


இடுகை நேரம்: செப்-18-2021